microRNA-33調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，由18~25個核苷酸組成。它通過特異性堿基配對方式結(jié)合到靶基因mRNA的3'UTR(untranslated region)，從而誘導(dǎo)靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)控基因的表達(dá)。先前的研究表明，miR-33a可以通過靶向結(jié)合ABCA1，沉默其表達(dá)，抑制apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇流出。然而,miR-33是否可以負(fù)性調(diào)控脂多糖(lipopolysacchar

2、ide，LPS)誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)尚知之甚少,仍有待研究。基于以上研究背景,我們以LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞建立炎癥模型,首次研究了miR-33在調(diào)控炎癥反應(yīng)中所起的作用,旨在闡明:
　　1.miR-33是否參與調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答;
　　2.探討miR-33參與調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的機(jī)制。
　　第一部分miR-33抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　首先,我們檢測 LPS誘導(dǎo)活化的T

3、HP-1巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答中miR-33表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo) THP-1巨噬細(xì)胞活化后，miR-33的表達(dá)顯著上調(diào)。隨著LPS濃度的增加，其miR-33的表達(dá)逐漸增加，說明其效應(yīng)具有LPS的濃度依賴性，并且在10 ng/ml LPS作用時變化最為顯著。隨后，我們將成熟 miR-33模擬物（miR-33 mimics）和miR-33阻遏物（miR-33 inhibitor）分別導(dǎo)入THP-1巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)，人為上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞內(nèi)m

4、iR-33的表達(dá)水平，進(jìn)而觀察細(xì)胞炎癥因子分泌情況的變化。實驗結(jié)果表明，miR-33可以負(fù)性調(diào)控LPS誘導(dǎo)活化的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答。
　　第二部分miR-33通過靶向作用于NRIP1抑制巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答
　　但是，miR-33是通過與哪些靶基因mRNA的3'UTR相結(jié)合，并負(fù)向調(diào)控 THP-1巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)的機(jī)制還不明確。我們通過Targetscan和MiRDB等 microRNAs靶向預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn) NRIP1

5、的3'UTR區(qū)含有miR-33的結(jié)合位點。NRIP1作為一種轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，通過激活核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路，從而調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。因此，我們擬選取 NRIP1作為研究的切入點，來探討miR-33對LPS刺激的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制。
　　通過雙熒光素酶報告基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)：miR-33可以有效的抑制NRIP1的3'UTR結(jié)合序列的報告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性。此外，

6、我們用RT-PCR及免疫印跡(western blot)方法檢測了轉(zhuǎn)染miR-33 mimics后內(nèi)源性NRIP1的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)被顯著抑制。由此我們可以得出結(jié)論，miR-33通過與 NRIP1的3'UTR相互作用,從而抑制其蛋白的表達(dá),最終抑制NRIP1信號通路的活化。
　　結(jié)論:
　　1. miR-33抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎性因子分泌，負(fù)性調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答;
　　2. mi