TLR4激活在糖尿病腎病炎癥反應(yīng)中的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要原因之一。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近些年慢性炎癥反應(yīng)在DN中的作用機(jī)制備受關(guān)注。Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)在介導(dǎo)多種細(xì)胞的信號激活及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，目前其在DM和DN發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注，臨床和實(shí)驗(yàn)研究中均證實(shí)高糖狀態(tài)下多

2、種細(xì)胞TLR4的表達(dá)顯著升高，但是TLR4升高在DM及DN發(fā)生發(fā)展中的詳細(xì)機(jī)制尚未完全闡明。因此，本課題依據(jù)文獻(xiàn)和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬通過體內(nèi)、體外研究高血糖狀態(tài)下高表達(dá)的TLR4，在不同配體的刺激下對腎小管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生的影響，探討TLR4激活在DN發(fā)病中的作用機(jī)制，以及對巨噬細(xì)胞募集、腎組織纖維化等的調(diào)節(jié)作用，從而提出新的針對DN炎癥反應(yīng)的治療策略，為DN免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、

3、研究高糖對HK-2和THP-1細(xì)胞TLR4表達(dá)及炎癥反應(yīng)的影響:用含不同濃度葡萄糖的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2和THP-1細(xì)胞，用免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)水平。分別用LPS和HSP60刺激含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞，在不同時(shí)間段(2、4、6、8h)收集細(xì)胞，Real-timePCR檢測炎癥因子（TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8）mRNA表達(dá)。
　　 2、研究巨噬細(xì)胞激活后上清對HK-2細(xì)胞的影

4、響:用LPS刺激THP-1后的上清液作用于HK-2細(xì)胞，觀察炎癥因子的產(chǎn)生。THP-1細(xì)胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)LPS刺激24h后取上清與高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞混合，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，Real-timePCR檢測HK-2細(xì)胞mRNA表達(dá);Westernblot檢測NF-κBp65表達(dá)水平;免疫組化檢測FN表達(dá)水平。
　　 3、制備2型糖尿病大鼠模型:腹腔注射低劑量STZ(45mg/kg)，72h后取尾靜脈血測定血糖，兩次

5、檢測濃度均大于16.7mmol/L時(shí)為造模成功。
　　 4、動(dòng)態(tài)觀察DM大鼠腹腔巨噬細(xì)胞激活的炎癥反應(yīng):在DM的2、4、8、12w取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用LPS刺激2、4、6h后收集細(xì)胞，Real-timePCR檢測TNF-α和IL-1β表達(dá)水平;在DM的2、4、8、12w取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，分別用LPS、HSP60刺激48h后收集上清，ELISA檢測上清中TNF-α和IL-1β的水平。
　　 5、動(dòng)態(tài)觀察DM大鼠的腎臟的

6、炎癥反應(yīng):在DM的2、4、8、12w取大鼠腎臟，Real-timePCR檢測TLR-4、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平;取腎臟做組織切片，HE染色觀察腎臟病變;免疫組化檢測FN的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、高糖環(huán)境能促進(jìn)入單核巨噬細(xì)胞THP-1和腎小管上皮細(xì)胞HK-2表面TLR4表達(dá)。
　　 2、高糖環(huán)境下的HK-2和THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS和HSP60刺激后TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8mRNA的

7、表達(dá)均顯著高于對照組。
　　 3、經(jīng)LPS刺激過的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用于HK-2細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8mRNA的表達(dá)均顯著高于空白對照組和高糖對照組;WesternBlot結(jié)果顯示:上清液作用HK-2細(xì)胞72小時(shí)后NF-κBp65的表達(dá)量要顯著增高;不同濃度的THP-1刺激上清液作用于HK-2細(xì)胞48h后，細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示:40％的刺激上清液作用于HK-2細(xì)胞FN的表達(dá)量顯著增高。<

8、br>　　 4、成功建立了2型糖尿病大鼠模型。
　　 5、Real-timePCR檢測經(jīng)LPS刺激的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:DM組腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α，IL-1β表達(dá)量的高峰值出現(xiàn)在LPS刺激后兩小時(shí)，且隨著DM大鼠時(shí)間的延長，刺激2h的表達(dá)量逐漸增高。
　　 6、ELISA檢測結(jié)果顯示:DM組2、4、8、12w獲取的巨噬細(xì)胞經(jīng)HSP60和LPS刺激后24h，TNF-α的表達(dá)

9、量逐漸增高，分別在8w、12w高峰值，可達(dá)到600pg/ml左右;IL-1β的表達(dá)量也逐漸增高，均在8w達(dá)到高峰值，可達(dá)到700pg/ml左右。
　　 7、2型糖尿病大鼠模型建立成功后，在不同時(shí)期取大鼠腎臟，Real-timePCR檢測TLR4，TNF-α，IL-1βmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:DM組12wTLR4的表達(dá)水平明顯高于同時(shí)期對照組，也高于DM組的其它時(shí)期;DM組的不同時(shí)期TNF-α表達(dá)水平與同時(shí)期對照組相比均有明顯

10、增高，DM組12wTNF-α的表達(dá)水平顯著高于同組其它時(shí)期;DM組的不同時(shí)期IL-1β表達(dá)水平與同時(shí)期對照組相比均有明顯增高，DM組8w、12wIL-1β的表達(dá)水平都要顯著高于同組2w、4w的表達(dá)水平。
　　 8、腎臟組織HE染色結(jié)果顯示:從DM4w開始，腎臟組織開始有少量的炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)出現(xiàn)輕微的纖維化，8w、12w時(shí)，浸潤腎臟的炎癥細(xì)胞逐漸增多，腎臟纖維化逐漸增強(qiáng)。
　　 9、腎臟組織免疫組化結(jié)果顯示:纖維連接

11、蛋白FN在DM4w時(shí)開始表達(dá)，隨著病情的進(jìn)展，F(xiàn)N表達(dá)逐漸增強(qiáng)，12w表達(dá)量最多。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)THP-1和HK-2細(xì)胞TLR4表達(dá)增加，且LPS和HSP60均可促進(jìn)高糖環(huán)境中的THP-1和HK-2細(xì)胞炎癥因子高表達(dá)。
　　 2、THP-1培養(yǎng)上清液作用于HK-2細(xì)胞可引起更加強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，且促進(jìn)HK-2細(xì)胞纖維連接蛋白FN的高表達(dá)。
　　 3、隨著大鼠糖尿病病程的進(jìn)展，腹腔