TLR4激活在糖尿病腎病炎癥反應(yīng)中的機制研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩78頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:
   糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最嚴重的并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要原因之一。其發(fā)病機制復(fù)雜,近些年慢性炎癥反應(yīng)在DN中的作用機制備受關(guān)注。Toll樣受體4(Toll-likereceptor4,TLR4)在介導(dǎo)多種細胞的信號激活及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,目前其在DM和DN發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注,臨床和實驗研究中均證實高糖狀態(tài)下多

2、種細胞TLR4的表達顯著升高,但是TLR4升高在DM及DN發(fā)生發(fā)展中的詳細機制尚未完全闡明。因此,本課題依據(jù)文獻和前期實驗結(jié)果,擬通過體內(nèi)、體外研究高血糖狀態(tài)下高表達的TLR4,在不同配體的刺激下對腎小管上皮細胞、巨噬細胞炎癥因子的產(chǎn)生的影響,探討TLR4激活在DN發(fā)病中的作用機制,以及對巨噬細胞募集、腎組織纖維化等的調(diào)節(jié)作用,從而提出新的針對DN炎癥反應(yīng)的治療策略,為DN免疫治療提供實驗依據(jù)。
   方法:
   1、

3、研究高糖對HK-2和THP-1細胞TLR4表達及炎癥反應(yīng)的影響:用含不同濃度葡萄糖的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2和THP-1細胞,用免疫熒光技術(shù)和流式細胞儀檢測細胞表面TLR4的表達水平。分別用LPS和HSP60刺激含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)的細胞,在不同時間段(2、4、6、8h)收集細胞,Real-timePCR檢測炎癥因子(TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8)mRNA表達。
   2、研究巨噬細胞激活后上清對HK-2細胞的影

4、響:用LPS刺激THP-1后的上清液作用于HK-2細胞,觀察炎癥因子的產(chǎn)生。THP-1細胞用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),經(jīng)LPS刺激24h后取上清與高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HK-2細胞混合,在不同時間點收集細胞,Real-timePCR檢測HK-2細胞mRNA表達;Westernblot檢測NF-κBp65表達水平;免疫組化檢測FN表達水平。
   3、制備2型糖尿病大鼠模型:腹腔注射低劑量STZ(45mg/kg),72h后取尾靜脈血測定血糖,兩次

5、檢測濃度均大于16.7mmol/L時為造模成功。
   4、動態(tài)觀察DM大鼠腹腔巨噬細胞激活的炎癥反應(yīng):在DM的2、4、8、12w取大鼠腹腔巨噬細胞,用LPS刺激2、4、6h后收集細胞,Real-timePCR檢測TNF-α和IL-1β表達水平;在DM的2、4、8、12w取大鼠腹腔巨噬細胞,分別用LPS、HSP60刺激48h后收集上清,ELISA檢測上清中TNF-α和IL-1β的水平。
   5、動態(tài)觀察DM大鼠的腎臟的

6、炎癥反應(yīng):在DM的2、4、8、12w取大鼠腎臟,Real-timePCR檢測TLR-4、TNF-α和IL-1β表達水平;取腎臟做組織切片,HE染色觀察腎臟病變;免疫組化檢測FN的表達。
   結(jié)果:
   1、高糖環(huán)境能促進入單核巨噬細胞THP-1和腎小管上皮細胞HK-2表面TLR4表達。
   2、高糖環(huán)境下的HK-2和THP-1細胞經(jīng)LPS和HSP60刺激后TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8mRNA的

7、表達均顯著高于對照組。
   3、經(jīng)LPS刺激過的THP-1細胞培養(yǎng)上清液作用于HK-2細胞后,實驗組TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-8mRNA的表達均顯著高于空白對照組和高糖對照組;WesternBlot結(jié)果顯示:上清液作用HK-2細胞72小時后NF-κBp65的表達量要顯著增高;不同濃度的THP-1刺激上清液作用于HK-2細胞48h后,細胞免疫組化結(jié)果顯示:40%的刺激上清液作用于HK-2細胞FN的表達量顯著增高。<

8、br>   4、成功建立了2型糖尿病大鼠模型。
   5、Real-timePCR檢測經(jīng)LPS刺激的大鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-1βmRNA表達水平。結(jié)果顯示:DM組腹腔巨噬細胞TNF-α,IL-1β表達量的高峰值出現(xiàn)在LPS刺激后兩小時,且隨著DM大鼠時間的延長,刺激2h的表達量逐漸增高。
   6、ELISA檢測結(jié)果顯示:DM組2、4、8、12w獲取的巨噬細胞經(jīng)HSP60和LPS刺激后24h,TNF-α的表達

9、量逐漸增高,分別在8w、12w高峰值,可達到600pg/ml左右;IL-1β的表達量也逐漸增高,均在8w達到高峰值,可達到700pg/ml左右。
   7、2型糖尿病大鼠模型建立成功后,在不同時期取大鼠腎臟,Real-timePCR檢測TLR4,TNF-α,IL-1βmRNA表達水平。結(jié)果顯示:DM組12wTLR4的表達水平明顯高于同時期對照組,也高于DM組的其它時期;DM組的不同時期TNF-α表達水平與同時期對照組相比均有明顯

10、增高,DM組12wTNF-α的表達水平顯著高于同組其它時期;DM組的不同時期IL-1β表達水平與同時期對照組相比均有明顯增高,DM組8w、12wIL-1β的表達水平都要顯著高于同組2w、4w的表達水平。
   8、腎臟組織HE染色結(jié)果顯示:從DM4w開始,腎臟組織開始有少量的炎癥細胞浸潤,腎間質(zhì)出現(xiàn)輕微的纖維化,8w、12w時,浸潤腎臟的炎癥細胞逐漸增多,腎臟纖維化逐漸增強。
   9、腎臟組織免疫組化結(jié)果顯示:纖維連接

11、蛋白FN在DM4w時開始表達,隨著病情的進展,F(xiàn)N表達逐漸增強,12w表達量最多。
   結(jié)論:
   1、高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)THP-1和HK-2細胞TLR4表達增加,且LPS和HSP60均可促進高糖環(huán)境中的THP-1和HK-2細胞炎癥因子高表達。
   2、THP-1培養(yǎng)上清液作用于HK-2細胞可引起更加強烈的炎癥反應(yīng),且促進HK-2細胞纖維連接蛋白FN的高表達。
   3、隨著大鼠糖尿病病程的進展,腹腔

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論