間歇性低氧對大鼠腦缺血后空間記憶及海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬的影響.pdf

1、目的：探討間歇性低氧對大鼠腦缺血后空間記憶及海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬的影響。
　　方法：本實驗將健康雄性 Wistar大鼠120只采用數(shù)字隨機法分成正常對照組（n=20）（UC組）、單純腦缺血組（n=20）（IR組）、間歇性低氧7天腦缺血組（IH7+IR組）（n=20）、間歇性低氧14天腦缺血組（IH14+IR組）（n=20）、間歇性低氧21天腦缺血組（IH21+IR組）（n=20）、間歇性低氧21天腦缺血+mTOR抑制劑組（抑制劑組）

2、（n=20）。間歇性低氧動物進入低氧艙，低氧箱內(nèi)氧氣濃度維持在5％~21%，形成周期循環(huán)，在低氧艙內(nèi)的暴露時間為7小時/天，分別持續(xù)7天、14天、21天。分別在低氧7天、14天、21天后將間歇性低氧動物制備腦缺血再灌注模型。采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制備腦缺血再灌注模型，分別于缺血15min再灌注后6h、24h兩個時間點處死大鼠。缺血再灌注后24h采用水迷宮法檢測各組大鼠視空間記憶能力。各組大鼠的標本采用蘇木素-伊紅染色

3、法（HE）檢測大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)的改變；采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR技術(shù)檢測大鼠腦組織海馬區(qū) PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表達情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進行重復(fù)設(shè)計的單因素方差分析，以P<0.05，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、水迷宮檢測結(jié)果：與 UC組比較，IR組大鼠水迷宮檢測的逃避潛伏期時間延長、穿臺次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與 IR組比較，各組間

4、歇性低氧+腦缺血大鼠的逃避潛伏期時間均延長、穿臺次數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠的逃避潛伏期時間均延長、穿臺次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠的逃避潛伏期時間均延長、穿臺次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠的逃避潛伏期時間減少、穿臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

5、<0.05）。2、細胞形態(tài)改變結(jié)果（HE染色）：UC組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，胞漿淡染，核仁明顯；與 UC組比較，IR組大鼠6h海馬區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)即出現(xiàn)改變，表現(xiàn)為細胞失去正常結(jié)構(gòu)，部分細胞形態(tài)異常；24h海馬區(qū)可見腫脹的神經(jīng)元，間質(zhì)水腫，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞出現(xiàn)核固縮、深染，也有部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)；各組間歇性低氧+腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)細胞破壞嚴重，均可見較多變性壞死的神經(jīng)細胞，海馬區(qū)可見腫脹

6、的神經(jīng)元，間質(zhì)水腫，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞出現(xiàn)核固縮、深染，也有部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠神經(jīng)元存活率均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠神經(jīng)元存活率均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+I

7、R組比較，抑制劑組大鼠神經(jīng)元存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3、PI3K免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果：免疫組化結(jié)果：PI3K免疫組化染色呈棕黃色，定位于細胞胞漿中，主要表達在神經(jīng)元細胞中；UC組偶見免疫陽性細胞，淡染，神經(jīng)細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯；與 UC組比較，IR組大鼠在各時間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時

8、間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）染色減弱，免疫陽性細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠染色增強，免疫陽性細胞數(shù)增加，

9、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析結(jié)果：與 UC組比較，IR組大鼠在各時間點（6h、24h）PI3K蛋白的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時間點（6h、24h）PI3K蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）PI3K蛋白的表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

10、5)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）PI3K蛋白的表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠PI3K蛋白的表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4、mTOR免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果：免疫組化結(jié)果：mTOR免疫組化染色呈棕黃色，定位于細胞胞漿中，主要表達在神經(jīng)元細胞中；UC組偶見免疫陽性細胞，淡染，神經(jīng)細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯；與 UC組

11、比較，IR組大鼠6h、24h染色均增強，免疫陽性細胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時間點

12、（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠染色減弱，免疫陽性細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析結(jié)果：與UC組比較，IR組大鼠在在各時間點（6h、24h）mTOR蛋白的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時間點（6h、24h） mTOR蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0

13、.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）mTOR蛋白的表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）mTOR蛋白的表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠mTOR蛋白的表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。5、beclin1免疫組化和RT-PCR分析結(jié)果：免疫組化結(jié)

14、果：beclin1免疫組化染色呈棕黃色，定位于細胞胞漿中，主要表達在神經(jīng)元細胞中；UC組偶見免疫陽性細胞，淡染，神經(jīng)細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯；與UC組比較，IR組大鼠6h、24h染色均增強，免疫陽性細胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21

15、+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）染色增強，免疫陽性細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）染色減弱，免疫陽性細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH21+IR組比較，抑制劑組大鼠染色增強，免疫陽性細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR分析結(jié)果：與 UC組比較，IR組大鼠在在各時間點（6h、24h）beclin1蛋白的表達

16、明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與 IR組比較，各組間歇性低氧+腦缺血組大鼠在各時間點（6h、24h）beclin1蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH7+IR組比較，IH14+IR組、IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h） beclin1蛋白的表達增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 IH14+IR組比較，IH21+IR組大鼠在各時間點（6h、24h）beclin1蛋白的表達減少，差異