間歇低氧損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬的表達(dá)及其作用研究.pdf

1、目的：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS），是一種發(fā)病率較高的睡眠呼吸障礙性疾病，同時(shí)也是神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。間歇低氧（IH）作為 OSAHS主要的病理生理學(xué)特征，其反復(fù)發(fā)生的低氧/復(fù)氧過(guò)程可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷。認(rèn)知功能障礙作為老年OSAHS患者常見(jiàn)并發(fā)癥，其發(fā)生機(jī)制可能與間歇低氧所致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)。自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理機(jī)制，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)自噬在缺血/缺氧所致系統(tǒng)性損傷中發(fā)揮重要作用。

2、然而在間歇低氧條件下，自噬激活的具體機(jī)制以及自噬對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的影響目前尚未清楚闡明。因此，本研究通過(guò)模擬人OSAHS建立間歇低氧模型，從體外實(shí)驗(yàn)角度觀察間歇低氧損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬的表達(dá)，并進(jìn)一步通過(guò)藥物干預(yù)檢測(cè)間歇低氧所致海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬流量的變化，擬探討自噬的激活在間歇低氧所致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法：取新生 SD乳鼠（24小時(shí)內(nèi)）海馬組織進(jìn)行原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，至第7天，采用免疫熒光對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。①建立

3、不同時(shí)間段的間歇低氧細(xì)胞模型，設(shè)正常對(duì)照組（NC）、間歇低氧組（IH）4h、間歇低氧組8h和間歇低氧組12h。間歇低氧組分別循環(huán)給予氧濃度為1.5％的低氧5min和21%的常氧10min處理4h、8h和12h，正常對(duì)照組持續(xù)給予氧濃度為21%的常氧。采用免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)間歇低氧不同時(shí)間段內(nèi)自噬特異性微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、Beclin1和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3）蛋白的表達(dá)，TUN

4、EL法檢測(cè)不同時(shí)間段內(nèi)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化。②給予自噬激活劑雷帕霉素和抑制劑氯喹預(yù)處理后再建立間歇低氧細(xì)胞模型，設(shè)正常對(duì)照組、間歇低氧組（12h）、藥物預(yù)處理組、單獨(dú)給藥組和饑餓組。間歇低氧組于間歇低氧艙內(nèi)處理12h；藥物預(yù)處理組分別給予雷帕霉素和氯喹稀釋液預(yù)處理12h后，再置于間歇低氧艙內(nèi)暴露12h；單獨(dú)給藥組分別給予雷帕霉素和氯喹處理12h；饑餓組即間歇低氧陽(yáng)性對(duì)照組給予EBSS無(wú)糖培養(yǎng)液培養(yǎng)12h。采用免疫印跡檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組自噬相

5、關(guān)蛋白LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化，即LC3-II/LC3-I和P62蛋白的表達(dá)。③實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓皩?shí)驗(yàn)分組同步驟②。采用免疫印跡檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組自噬相關(guān)蛋白LC3-II和cleaved caspase-3的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組LC3蛋白表達(dá)，TUNEL檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化。
　　結(jié)果：①間歇低氧對(duì)新生鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：間歇低氧組自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)明顯增多，且隨著間歇低

6、氧時(shí)間的延長(zhǎng)LC3和Beclin1表達(dá)也逐漸增多。間歇低氧12h表達(dá)最多，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.05）。②間歇低氧對(duì)新生鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬流量的影響：與正常對(duì)照組相比，間歇低氧組LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著增多，而P62蛋白表達(dá)則明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.05）；與雷帕霉素單獨(dú)給藥組相比，雷帕霉素+間歇低氧組LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著增高，而P62蛋白表達(dá)則明顯降低，差異均具有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.05）；與氯喹單獨(dú)給藥組相比，氯喹+間歇低氧組LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著增高，P62蛋白表達(dá)則明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（***P<0.05）；與正常對(duì)照組和DMSO組相比，雷帕霉素單獨(dú)給藥組 LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.05），而DMSO組與正常對(duì)照組相比LC3-II/LC3-I表達(dá)無(wú)顯著差異；與正常組相比，EBSS組LC3-II/LC3-I表

8、達(dá)顯著增高，而P62蛋白表達(dá)則顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05），但與間歇低氧組相比，LC3-II/LC3-I和P62表達(dá)均無(wú)明顯差異。③干預(yù)自噬流量對(duì)間歇低氧所致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響：間歇低氧組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和cleaved caspase-3表達(dá)明顯增高，且隨著IH時(shí)間的延長(zhǎng)，二者表達(dá)也逐漸增多。間歇低氧12h表達(dá)最多，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.05）；雷帕霉素+間歇低氧組cleaved cas

9、pase-3表達(dá)和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著高于間歇低氧組。而氯喹+間歇低氧組cleaved caspase-3表達(dá)和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較間歇低氧組明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.05，***P<0.05）；雷帕霉素單獨(dú)給藥組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)和凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05），但DMSO組與正常對(duì)照組相比cleaved caspase-3表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　結(jié)