選擇標記基因熱激刪除型雙元表達載體構(gòu)建與功能驗證.pdf

1、自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植株以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛用于改良植物的遺傳性狀。為了把轉(zhuǎn)基因細胞和非轉(zhuǎn)基因細胞分離開來，在轉(zhuǎn)基因過程中往往引入了選擇標記基因。選擇標記基因的引入，使得轉(zhuǎn)基因材料具有抗某種抗生素或化學物質(zhì)的能力，如含有nptⅡ基因的植株具有抗卡那霉素的特性。然而，利用選擇標記基因至少存在4個方面的問題：1．對植物細胞的增殖和分化有不利的影響，2．對環(huán)境存在潛在危害，3．在食用上有一定的安全風險和消費心理障礙，4．不便于采用已成

2、熟的條件進行重復(fù)轉(zhuǎn)化。事實上，在獲得轉(zhuǎn)基因細胞或植株后，選擇標記基因已不再需要，可以予以刪除。目前刪除選擇標記基因的方法主要有共轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、同源重組和特異位點重組酶系統(tǒng)(R/RS、Cre/LoxP、FLP/FRT)等。其中，尤以特異位點重組酶系統(tǒng)研究的最為深入，但仍存在系統(tǒng)不穩(wěn)定、刪除困難或刪除不完全等問題，有待進一步完善。 本研究利用嚴謹性熱激啟動子HSP70m控制Cre/LoxP刪除系統(tǒng)、利用ipt基因促進轉(zhuǎn)基因材料在

3、不加細胞分裂素的培養(yǎng)基上進行不定芽分化、利用Kan抗性基因和ipt基因?qū)D(zhuǎn)基因細胞進行雙重選擇以期減少假陽性，而在獲得轉(zhuǎn)基因試管苗后熱激刪除Kan和ipt選擇標記等基因，使因枷基因表達所導(dǎo)致的畸形苗恢復(fù)正常生長，從而獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植株。主要實驗結(jié)果如下： 1、克隆了ipt和cre基因。 采用高保真的pfuDNA聚合酶和特異引物，分別從農(nóng)桿菌菌株C58和大腸桿菌菌株BM25.8的基因組中擴增出ipt基因和cre

4、基因，TA克隆后測序，結(jié)果與GenBank中公布的序列一致。 2、構(gòu)建了具有Kan和ipt選擇標記基因與Cre/LoxP熱激刪除系統(tǒng)的植物基因表達載體。 成功構(gòu)建了pQSL05、pQSL15和pQSL16三個植物基因雙元表達載體。其中，pQSL05中僅含有35S—ipt而無Kan抗性基因，用以分析單獨的ipt基因作為選擇標記基因時的篩選效果。pQSL15中含有Kan抗性基因和Cre/LoxP系統(tǒng)，用以建立Kan抗性基因的

5、刪除技術(shù)并分析刪除效果。pQSL16中含有Kan抗性基因、野生型ipt基因和熱激啟動子控制Cre/LoxP刪除系統(tǒng)，用以獲得ipt促進轉(zhuǎn)化子分化、進行Kan與ipt雙重篩選、熱激誘導(dǎo)刪除等在煙草材料上使用的具體技術(shù)參數(shù)。 3、在煙草上成功驗證了所構(gòu)建的選擇標記基因熱激刪除系統(tǒng)。 通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，分別得到三種不同表型的轉(zhuǎn)基因植物。 (1)用pQSL05轉(zhuǎn)化煙草，得到了經(jīng)PCR擴增鑒定的轉(zhuǎn)基因植株，而且在不加

6、BA的培養(yǎng)基上，ipt基因即能促進大量不定芽產(chǎn)生，但由于ipt基因組成性過量表達，生成的不定芽均為畸形，并且很難生根；因此，組成性表達的ipt難以單獨作為選擇標記基因使用。 (2)用pQSL15轉(zhuǎn)化煙草，得到的轉(zhuǎn)基因植株根部在常溫下可以在熒光顯微鏡下觀察到有GFP綠色熒光，說明該載體的T-dNA已經(jīng)成功整合到煙草的基因組中。經(jīng)過熱激處理后，煙草轉(zhuǎn)基因植株在含有Kan的培養(yǎng)基上逐漸白化而死亡，而在不含Kan的培養(yǎng)基上生長正常且觀察

7、不到GFP綠色熒光。提取常溫下的試管苗和熱激后產(chǎn)生無綠色熒光的試管苗的總DNA，用特異引物擴增，在常溫下的轉(zhuǎn)基因試管苗的總DNA中可以得到gfp和nptⅡ基因的片段，而在熱激后的試管苗的總DNA得不到以上的片段，表明由HSP70m控制的Cre/LoxP系統(tǒng)能通過熱激有效刪除了選擇標記基因。 (3)用pQSL16轉(zhuǎn)化煙草，得到了與轉(zhuǎn)pQSL05相似畸形性狀的轉(zhuǎn)基因試管苗。通過熱激處理，畸形轉(zhuǎn)基因試管苗在含有Kan的培養(yǎng)基上慢慢地白