蠟梅擴張蛋白基因CpEXP1的表達分析及其功能驗證.pdf

1、蠟梅(Chimonanthus praecox(Linn.) Link)，蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(ChimonanthusLindl.)木本植物，原產(chǎn)于我國。其冬季開花色澤金黃并帶有香味，是名貴的木本切花。但在蠟梅切枝采收以及貯藏運輸過程中容易落蕾落花，尤其是中蕾期花蕾的脫落直接影響了蠟梅作為鮮切花的開發(fā)應(yīng)用。以往關(guān)于蠟梅切花保鮮的研究基本停留在生理生化水平，而且缺少對落蕾問題的專門研究。
　　近些年研究發(fā)現(xiàn)

2、，擴張蛋白與器官脫落關(guān)系密切。2009年，我們在蠟梅的研究中分離得到CpEXP1基因(GeneBank accession no.JN700522)，序列分析及同源性比較發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆讦?擴張蛋白基因。但該基因的功能尚未明確。如果該基因的表達與蠟梅花蕾脫落存在相關(guān)性，我們就可以考慮通過調(diào)控該基因的表達來進一步深入探索蠟梅花蕾脫落的機理，為尋找抑制蠟梅花蕾脫落的措施提供新思路。
　　本研究以素心蠟梅（Ch.praecox var.c

3、oncolor Makino）為材料，在克隆CpEXP1基因的基礎(chǔ)上進行了原核表達和重組蛋白活性分析;并對不同組織、不同開花階段中CpEXP1基因的表達進行了研究;在花蕾脫落力分級的基礎(chǔ)上對蠟梅花梗離層形成解剖結(jié)構(gòu)、CpEXP1基因的表達以及擴張蛋白活性的相關(guān)性進行了分析;通過構(gòu)建植物表達載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，對該基因的其它功能進行了鑒定。最后，對CpEXP1基因啟動子進行了克隆和功能分析。主要結(jié)果如下:
　　(1)原核表達及其產(chǎn)物活

4、性分析
　　成功構(gòu)建了原核表達載體pET32a(+)-CpEXP1，將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達獲得了CpEXP1重組蛋白。利用MagneHisTM蛋白純化回收試劑盒獲得了純化的重組蛋白?；钚詼y定表明，CpEXP1重組蛋白具有體外活性，能夠促進大豆幼苗下胚軸的伸長。將提取的重組蛋白添加到不同培養(yǎng)階段的麻點百合培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)重組蛋白對麻點百合愈傷組織的分化無顯著影響，但對增殖以及生根有明顯促進作用，并且隨著重組蛋白濃

5、度的增加，增殖率以及生根率顯著提高，組培苗長勢也顯著增強。
　　(2)蠟梅開花階段劃分與脫落力分級
　　素心蠟梅花蕾著生以1級分枝為主，其中短于20cm的中等枝以及短枝占80.0％，花蕾著生量占82.4％，構(gòu)成了蠟梅切枝的主要觀賞枝組;以花蕾發(fā)育過程中花徑、雌雄蕊形態(tài)以及香味等作為依據(jù)，將素心蠟梅的開花過程劃分為小蕾期、中蕾期、大蕾期、初開期、盛開期、初萎期和萎蔫期7個階段;采用單因子實驗對蕾徑、莖粗以及斷面直徑與脫落力的關(guān)

6、系進行了研究，發(fā)現(xiàn)莖粗與花蕾脫落力關(guān)系最為密切，相關(guān)性R2為0.1216，依次是蕾徑和斷面直徑，相關(guān)性R2分別為0.0409、0.0369;以脫落力為依據(jù)，將蠟梅中蕾期花蕾分為4組，即Ⅰ:0N＜脫落力＜1.4N，Ⅱ:1.4≤脫落力＜2.8N，Ⅲ:2.8≤脫落力＜4.2N，Ⅳ:脫落力≥4.2N。
　　(3) CpEXP1基因在蠟梅中的表達及其與擴張蛋白活性、離層形成相關(guān)性分析
　　采用實時熒光定量PCR技術(shù)對蠟梅不同組織、不同

7、開花階段以及不同脫落力花梗中CpEXP1基因的表達進行了分析。結(jié)果表明，CpEXP1基因的表達量存在明顯的時空特異性。其中在花器官的表達量明顯高于營養(yǎng)器官。11個組織中Cp EXP1基因的表達由高到低依次是雄蕊、內(nèi)花被片、雌蕊、全花、中花被片、外花被片、成熟葉片、根、莖、子葉、幼葉;在花發(fā)育不同階段分析中，萎蔫期花蕾中未提取到RNA，其余6個階段中CpEXP1基因的表達也存在差異。表達量由高到低依次是:初開期、盛開期、大蕾期、中蕾期、初

8、萎期、小蕾期;在不同脫落力下的花梗分析中，自然脫落花梗中CpEXP1基因的表達量最高，依次是:A(0N＜脫落力＜1.4N)、D（脫落力≥4.2N）、C（2.8≤脫落力＜4.2N）、B（1.4≤脫落力＜2.8N）。通過對不同脫落力下的花梗中擴張蛋白活性的測定，發(fā)現(xiàn)擴張蛋白的活性與CpEXP1基因的表達存在正相關(guān)。
　　采用查狄倫測力計以及蛋白體外重組法對瓶插蠟梅花梗脫落力和蛋白活性進行了研究，同時采用石蠟切片法對花梗離層的形成進行了

9、觀察。結(jié)果表明:1）脫落力與落蕾量呈負相關(guān)，與花梗離層發(fā)育正相關(guān)，脫落力可以作為離層發(fā)育階段的劃分依據(jù);2）在脫落過程中，CpEXP1基因的表達及其產(chǎn)物主要在蠟梅花蕾離層發(fā)育后期起作用。在瓶插前期，擴張蛋白活性和CpEXP1基因的表達量都穩(wěn)定在相對較低的水平，脫落力下降和離層的發(fā)育也相對緩慢。到了后期，該基因的表達和蛋白活性迅速增強，此時脫落力顯著下降，離區(qū)細胞嚴重解體并導(dǎo)致離區(qū)斷裂。
　　(4) CpEXP1基因植物表達載體構(gòu)建

10、及在擬南芥中的表達
　　根據(jù)NCBI登錄的核苷酸序列，克隆了蠟梅CpEXP1基因的cDNA編碼框全長，并構(gòu)建了該基因的植物表達載體CpEXP1-2301G。通過花序浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代。和野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序和葉片長度、葉形指數(shù)、葉表絨毛密度均較野生型增加，而葉寬變化不明顯。轉(zhuǎn)基因植株葉片邊緣反卷、畸形，葉片枯萎期、花期以及果實成熟期也均較野生型提前。果柄脫落力測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株成熟果莢果柄處脫落力

11、較野生型明顯降低。表明CpEXP1基因的表達與形態(tài)建成、生長發(fā)育周期以及脫落密切相關(guān)。
　　(5)蠟梅CpEXP1基因啟動子的克隆、生物信息學及表達分析
　　利用hiTAIL-PCR法分離得到了長度為2521bp的CpEXP1基因啟動子區(qū)序列CpEXP1-pro。該啟動子除具有啟動子基本元件外，還含有多種光應(yīng)答元件、高溫及低溫脅迫響應(yīng)元件、水楊酸相應(yīng)元件以及與種子和胚乳特異表達相關(guān)的元件。成功構(gòu)建了植物表達載體PBI121-

12、CpEXP1-pro，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入煙草進行瞬時表達，檢測到該啟動子能夠驅(qū)動GUS基因的表達。將CpEXP1-pro啟動子導(dǎo)入擬南芥中。GUS染色發(fā)現(xiàn)，在種子萌芽期和開花結(jié)實期該啟動子活性最強，子葉期以及真葉幼苗期未檢測到GUS活性;葉片染色發(fā)現(xiàn)該啟動子隨著葉片成熟衰老表達活性逐漸增強，尤其在老葉葉柄處活性最強;在果莢發(fā)育前期，GUS活性最強，隨后逐漸降低。當果莢成熟時僅在果柄處檢測到活性。表明CpEXP1-pro啟動子的啟動