靶向高遷移率族蛋白1基因的RNA干擾序列篩選及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、目的：篩選抑制高遷移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)基因表達(dá)的高效小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)序列，并觀察其在體外對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用，為以后膿毒癥治療的提供新的思路。
　　方法：根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)的通用原則設(shè)計(jì)3條HMGB1 siRNA序列(位點(diǎn)為1550-1570；775-795；1719-1739)分別命名為HMGB1 siRNA1、HMGB

2、1 siRNA2、HMGB1 siRNA3，BLAST比對(duì)以確保所設(shè)計(jì)的序列不與其他基因同源，用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成三條siRNAs，然后轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞。用500ng/ml LPS刺激轉(zhuǎn)染過siRNAs的細(xì)胞，然后逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transcription Polymerase ChainReaction，RT-PCR)檢測(cè)HMOB lmRNA的表達(dá)情況，同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme

3、-linked immunoabsorbent Assay，ELISA)測(cè)定細(xì)胞上清液中HMGB1的釋放是否受到抑制。將篩選出的高效干擾序列稀釋成不同的濃度，轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后分別用500ng/ml LPS誘導(dǎo)，然后檢測(cè)其是否以濃度依賴性的方式抑制HMGB1mRNA表達(dá)和HMGB1蛋白釋放，同時(shí)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白介素1β(i

4、nterleukin-1β，IL-1β)含量。
　　結(jié)果：在體外用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈siRNA在3％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示RNA片段長(zhǎng)度和預(yù)計(jì)的21bp相符，這提示本實(shí)驗(yàn)體外合成siRNA成功。合成的三條HMGB1 siRNA均能有效的抑制HMGB1mRNA表達(dá)和減少HMGB1蛋白的釋放，且其中一條HMGB1 siRNA的抑制效果最明顯。為了觀察HMGB1 siRNA抑制效應(yīng)的持續(xù)性，本實(shí)驗(yàn)在LPS刺激轉(zhuǎn)染

5、細(xì)胞24小時(shí)后繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)，也檢測(cè)其對(duì)HMGB1mRNA表達(dá)和HMGB1蛋白釋放的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1 siRNA也具備抑制效應(yīng)，但效果不如24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。我們將篩選出的抑制效果最好的HMGB1 siRNA稀釋成不同濃度預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1 siRNA以劑量依賴性抑制HMGB1。同時(shí)檢測(cè)其是否抑制炎癥反應(yīng)中的其它炎性因子，ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TNF-α、IL-1β含量顯著降低，TNF-α在24小

6、時(shí)這個(gè)時(shí)間點(diǎn)抑制效果最明顯，而IL-1β在抑制效果最明顯出現(xiàn)在16小時(shí)。為了評(píng)估siRNA的治療效應(yīng)，我們用LPS刺激RAW264.712小時(shí)后轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA。結(jié)果顯示：與單獨(dú)用轉(zhuǎn)染試劑處理的細(xì)胞相比，不同濃度HMGB1 siRNA。均能抑制HMGB1mRNA表達(dá)，也抑制HMGB1釋放。
　　結(jié)論：T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法合成的siRNA量大是一種簡(jiǎn)單而快速的方法，該方法合成的siRNA能在體外有效降低HMGB1和