SELEX法篩選果蠅神經(jīng)特異性拼接因子Dxl6的配體.pdf

1、前體 mRNA 的選擇性剪接發(fā)生頻率很高，它在人類基因組中廣泛存在，是增加蛋白質(zhì)多樣性及基因表達復雜程度的主要原因。近來研究顯示，一些富含絲氨酸和精氨酸蛋白(SR 蛋白)對于剪接的順利完成有著至關重要的作用。SR 蛋白是具有幫助識別正確剪接位點并促進剪接體的成熟的一類重要剪接因子，為組成性剪接所必需，在選擇性剪接中更起著不可替代的作用。 Dx16基因是 2000 年克隆的一種新基因。根據(jù)氨基酸序列和核酸序列推測它可能是剪接因

2、子的候選基因。原位雜交顯示，Dx16基因主要在后期胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)表達，與神經(jīng)發(fā)育相關。誘變劑 EMS (甲基磺酸乙酯)所致 Dx16 的 2 核甘酸缺失突變導致果蠅胚胎后期或 1 齡幼蟲致死。P 因子插入突變(插入內(nèi)含子區(qū)域)引起三齡幼蟲或后期蛹致死，但約有5﹪的逃逸者，這些逃逸者發(fā)育延遲并發(fā)有剛毛、翅膀、眼睛、腿等器官的發(fā)育異常。為了深入研究Dx16蛋白的功能，了解其在果蠅胚胎和胚胎后期及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，本文用SELEX方法篩選

3、到了 Dx16 可能的作用靶序列。 首先，將Dx16氨基端含兩個 RNA 識別基序的基因片段構建入原核表達載體，通過摸索各種條件，成功地以可溶的形式表達了融合蛋白，并用 GST 親合層析柱進行了純化，給后續(xù)的實驗提供了較好的工具。 其次，經(jīng)分離純化的Dx16N-GST 融合蛋白與RNA文庫在一定條件下孵育結(jié)合，共進行六輪 SEIEX 篩選，得到了Dx16可能作用的靶序列，并用 EMSA 驗證了它們之間的相互作用。