單核細胞增多性李斯特菌溶血素LLO的功能關鍵位點鑒定及表面展示系統(tǒng)的構建.pdf

1、單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），簡稱單增李斯特菌，是一種革蘭氏陽性、食源性胞內病原菌。LM主要通過分選酶（Sortase）系統(tǒng)將含有LPXTG基序的蛋白錨定至胞壁并發(fā)揮相應功能。溶血素Listeriolysin O（LLO）是屬于依賴于膽固醇的膜穿孔蛋白家族（CDCs），在游離狀態(tài)下可以形成直徑35 nm的孔狀結構，插入到宿主細胞膜內，在李斯特菌逃離到細胞質中扮演著重要的角色。
　　本

2、研究分別以單增李斯特菌參考菌株EGD-e和弱毒株M7溶血素蛋白（Listeriolysin O，LLO）為研究對象，通過同源重組及氨基酸突變技術將編碼LLO蛋白的基因hly在基因組水平上進行如下修飾：（1）構建LLO缺失突變株（ΔLLO）；（2）將野生株LLO蛋白第472-483位氨基酸缺失，使其形成攜帶LPXTG基序的重組LLO菌株（LLOLPXTG）。Western blot試驗結果顯示EGD-e和M7菌株缺失LLO后均未檢測到LL

3、O蛋白的表達，而LLOLPXTG缺失株檢測到重組LLO蛋白的表達，證實ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株均構建成功；鼠源巨噬細胞RAW264.7胞內增殖試驗表明，EGD-e的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的胞內增殖力顯著減弱；溶血試驗表明，M7的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的溶血活性完全喪失。體外原核表達純化LLO及其第472-483位氨基酸突變體蛋白，并研究其體外溶血活性。結果顯示只有LLO第478和479位氨基

4、酸影響LLO的溶血活性。體內外試驗表明單增李斯特菌LLO蛋白與細菌感染宿主細胞后的增殖能力密切相關。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實LLO第472-483位氨基酸為其關鍵位點，決定了LLO的活性及功能。LLO缺失株的構建可以為細菌體內表面展示技術在宿主細胞內進行抗原展示和遞呈的研究奠定重要基礎。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實單增李斯特菌LLO第472-483位氨基酸為其關鍵位點或功能域，決定了LLO的活性及功能；單增李斯特菌LLOLPX