單核細(xì)胞增多性李斯特菌PCR和PCR-ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、李斯特菌屬(Listeriaspp.)是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，屬內(nèi)包括單核細(xì)胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)、綿羊李斯特菌(L.ivanovii)、英諾克李斯特菌(L.innocua)、威爾斯李斯特菌(L.welshimeri)、西爾李斯特菌(L.seelieri)和格氏李斯特菌(L。grayi.)等6個(gè)種。李斯特菌在自然界中廣泛存在，其中單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)對(duì)人和多種

2、動(dòng)物具有致病性，在國(guó)內(nèi)外食品安全檢測(cè)與控制中日益受到重視。LM在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品中威脅人類(lèi)健康的主要病原菌之一。同時(shí)，單核細(xì)胞增多李斯特菌作為研究胞內(nèi)菌感染和細(xì)胞免疫的良好模型，已經(jīng)引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)LM的研究尚不深入，工作實(shí)踐中使用的檢驗(yàn)方法也主要采用二次增菌后分離鑒定，煩瑣、費(fèi)時(shí)，迫切需要建立敏感、特異、高通量的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。在LM中存在兩個(gè)主要的毒力島，即LIPI-1毒力島(Liste

3、riapathogenicityisland1)和LIPI-2(Listeriapathogenicityisland2)，其中，IPIL-1也稱(chēng)為prfA基因簇，是主要毒力因素，由prfA，plcA、hly、mpl，actA和plcB構(gòu)成，由prfA進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。本研究旨在對(duì)食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌污染狀況、LM的生物學(xué)特性、LIPI-1毒力島全基因序列以及分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行研究，為系統(tǒng)開(kāi)展LM致病機(jī)理研究、開(kāi)發(fā)新型疫苗載體等

4、工作奠定基礎(chǔ)，為檢驗(yàn)檢疫工作提供檢測(cè)技術(shù)支持，為開(kāi)展食品中LM的防控提供依據(jù)。 1.單核細(xì)胞增多性李斯特菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究 按照檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T0148.1-2005)對(duì)156個(gè)動(dòng)物源性食品樣品進(jìn)行了LM的分離鑒定，從中分離到7株單核細(xì)胞增多性李斯特菌，表明在動(dòng)物源性食品中存在LM污染，該結(jié)果將為進(jìn)行食品中LM的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等工作提供參考依據(jù)。以參考菌株CCTCCAB97021和C53004為參照，對(duì)LM

5、分離菌株XFL0605進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)(LD50測(cè)定)和溶血活性檢測(cè)。在溶血素(LLO)溶血活性實(shí)驗(yàn)中，相同培養(yǎng)條件下，3個(gè)試驗(yàn)菌株培養(yǎng)上清中LLO的含量存在差異，但產(chǎn)生的單位濃度LLO活性相當(dāng)，推測(cè)菌株XFL0605產(chǎn)生LLO的能力較參考菌株CCTCCAB97021和C530042株LM菌株弱。分離菌株XFL0605培養(yǎng)上清溶血活性與其它試驗(yàn)菌株相當(dāng)，但小鼠毒力(LD50)方面較其它實(shí)驗(yàn)菌株略低，該菌對(duì)昆明鼠的LD50為

6、2.58×105CFU/mL，推測(cè)該菌株致病性差異可能由于LLO等相關(guān)毒力因子的表達(dá)差異所致。試驗(yàn)結(jié)果還證明，溶血素在pH5.6時(shí)活性最高，在pH7.0時(shí)活性基本喪失。對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株XFL0605對(duì)常用藥物(氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星)敏感性較高，為在分子生物學(xué)改造研究中，選擇抗性篩選標(biāo)記提供了依據(jù)。 為方便、精確的檢測(cè)溶血素活性，建立了分光光度法檢測(cè)LM溶血素(LLO)活性

7、，本方法中綿羊紅細(xì)胞(SRBC)濃度與A540相關(guān)系數(shù)為0.99995，表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，能夠直接對(duì)LLO溶血活性進(jìn)行量化分析。分離菌株XFL0605、2個(gè)參考菌株C53004和CCTCCAB97021培養(yǎng)上清半數(shù)溶血值(HC50)測(cè)定結(jié)果分別是18.85、19.68和21.38，與測(cè)定的LLO含量(分別為1.305、1.530和1.749mg/mL)的呈正相關(guān)性，表明3個(gè)LM菌株產(chǎn)生的單位含量LLO溶血活性相當(dāng)，該結(jié)論在對(duì)3個(gè)菌株

8、hlyA基因克隆測(cè)序后得到印證。本研究建立的分光光度法檢測(cè)LM溶血素活性的方法具有相關(guān)系數(shù)高、敏感和判定客觀的特點(diǎn)，較好的解決了菌株LLO溶血活性檢測(cè)與鑒定問(wèn)題，為進(jìn)一步測(cè)定單核細(xì)胞增多性李斯特菌溶血素(LLO)編碼基因表達(dá)產(chǎn)物活性檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究還改進(jìn)和建立了微量反應(yīng)板梯度稀釋法檢測(cè)溶血素的方法，該方法直觀、操作方便。 2.單核細(xì)胞增多性李斯特菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究 針對(duì)LM的hlyA基因設(shè)計(jì)特異性引物和探

9、針，PCR擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為348bp，建立了PCR和PCR-ELISA.檢測(cè)食品樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的方法。本研究建立的PCR-ELISA方法中，在上游引物5’端標(biāo)記生物素，核酸探針的3’端標(biāo)記地高辛，將PCR擴(kuò)增、核酸液相雜交以及酶聯(lián)顯色技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物上標(biāo)記的生物素與包被在微孔板上的鏈霉親和素結(jié)合，標(biāo)記有地高辛的探針與產(chǎn)物雜交，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體結(jié)合，經(jīng)底物顯色。經(jīng)對(duì)試驗(yàn)菌株檢測(cè)表明，PCR、PCR-E

10、LISA方法檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯特菌能擴(kuò)增出特異片段，其它李斯特屬的綿羊李斯特菌、英諾克李斯特菌、威爾斯李斯特菌、西爾李斯特菌和格氏李斯特菌、大腸桿菌、葡萄球菌和沙門(mén)氏菌等擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果是陰性。對(duì)相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)NaOH濃度為0.3mol/L，雜交時(shí)間60min，酶反應(yīng)時(shí)間為45min時(shí)，結(jié)果較好，洗板液以pH7.4TBS-T為最佳。與PCR產(chǎn)物電泳法檢測(cè)比較，PCR-ELISA的敏感性是前者156倍以上，并適合批量樣品的檢測(cè)分析

11、。對(duì)60個(gè)樣品檢測(cè)表明，與SN/T0148.1-2005方法(引用ISO11290-1:2004)相比，PCR和PCR-ELISA方法具有更高的敏感性，表明本方法可以用于肉類(lèi)食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的快速診斷，具有敏感、特異、快速，重復(fù)性良好，無(wú)溴乙錠污染以及適合批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化后可望作為食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的常規(guī)檢測(cè)方法。 3.單核細(xì)胞增多性李斯特菌IPIL-1全基因克隆與序列分析 參考Genb

12、ank中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌LIPI-1有關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，分段擴(kuò)增，再進(jìn)行編碼核苷酸序列拼接，克隆了單核細(xì)胞增多性李斯特菌分離菌株XFL0605LIPI-1毒力島全基因，序列全長(zhǎng)為8558bp，AccessionNo.EF661572，包括了完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB等6個(gè)基因。 對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌XFL0605株LIPI-1編碼的6個(gè)毒力基因核苷酸序列進(jìn)行分析表明，各毒力基因反映

13、出來(lái)的進(jìn)化關(guān)系不盡一致，表明該菌株在獲得LIPI-1外源性毒力基因方面具有不同步性，各毒力基因的來(lái)源也不盡相同。對(duì)XFL0605菌株中LIPI-1各毒力基因所推導(dǎo)氨基酸序列N端作信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，PlcA、LLO、Mpl、ActA和PlcB5個(gè)毒力蛋白中均存在信號(hào)肽序列；actA基因推導(dǎo)氨基酸序列中存在跨膜區(qū)(578-600位編碼氨基酸)，其跨膜蛋白為I型。LIPI-1序列中存在5個(gè)14bp的PrfA蛋白結(jié)合區(qū)，分別位于plcA上

14、游59-73bp處，prfA上游62-75bp處，hlyA基因的上游183-196bp處，mpl上游185-198bp和actA基因上游185-198bp處。這些核苷酸序列是調(diào)控蛋白PrfA的結(jié)合位點(diǎn)，并具有回文結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。 對(duì)3個(gè)菌株(XFL0605、C53004和CCTCCAB97021)hlyA基因和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)三者具有高度同源性，hly基因同源性在96.9％-100％之間，氨基酸同源性在97.9％以上，

15、并具有相同的PEST基序和C端保守11肽序列，表明所測(cè)定3個(gè)菌株培養(yǎng)上清中LLO活性基本相當(dāng)具有遺傳基礎(chǔ)。對(duì)克隆的hlyA基因所推導(dǎo)溶血素氨基酸序列進(jìn)行PEST分析結(jié)果表明，編碼LLO的N端32-50位氨基酸序列(KENSISSMAPPASPPASPK)為富含P(脯氨酸)、E(谷氨酸)、S(絲氨酸)和T(蘇氨酸)的PEST(Pro-Glu-Ser-Thr)基序，PESTfind值為4.71。試驗(yàn)菌株XFL0605actA基因編碼604個(gè)