質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對BRL細(xì)胞HP450基因表達及細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：以pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒為載體，設(shè)計構(gòu)建特異性針對HP450基因 shRNA真核表達載體，并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染正常的大鼠肝細(xì)胞株（BRL），以探討靶向干擾HP450基因?qū)RL細(xì)胞生長增殖的影響，為今后研究HP450基因?qū)RL細(xì)胞功能的影響提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：1. pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表達載體的構(gòu)建：針對HP450基因設(shè)計合成特異性DNA片段以及一對無關(guān)序列的陰性對照DNA片段，將它們插

2、入真核表達質(zhì)粒 pGPH1/GFP/Neo中構(gòu)建重組載體。2.大鼠肝細(xì)胞株BRL pGPH1/GFP/Neo-HP450質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表達載體轉(zhuǎn)染至大鼠肝細(xì)胞株（BRL），并于轉(zhuǎn)染后6h、12h、24h在熒光倒臵顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。3. pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BRL對HP450基因表達的影響：實驗分為三組，即空白對照組、陰性對照組、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，運用逆轉(zhuǎn)錄-

3、聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對各組HP450基因表達進行檢測分析。4. pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BRL對細(xì)胞生長增殖的影響：采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞的生長狀態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的周期時相分布。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建針對 HP450基因 shRNA真核表達載體pGPH1/GFP/Neo-HP450，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞株 BRL，經(jīng)RT-PCR檢測，結(jié)果顯示該重組載體能夠特異性下調(diào)BRL

4、細(xì)胞中HP450的表達水平，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組對比，差異有顯著性（P<0.05），HP450基因表達下調(diào)達40％。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較，MTT結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組對BRL細(xì)胞增殖有促進作用（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)顯示G1期空白對照組細(xì)胞為86.45%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為58.30%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比空白對照組降低了32.56%；S期細(xì)胞空白對照組為8.29%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為30.57%，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較提高了2.69倍，結(jié)果提