MCUR1介導(dǎo)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑調(diào)控ROS產(chǎn)生促進(jìn)肝癌生長的作用機(jī)制研究.pdf

1、線粒體鈣穩(wěn)態(tài)對線粒體功能及細(xì)胞的影響至關(guān)重要，線粒體鈣維持胞漿鈣離子濃度動態(tài)平衡，是線粒體呼吸功能的重要調(diào)節(jié)因素，鈣離子失衡導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑是多種疾病發(fā)生的主要原因，但這一改變是否在腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用尚無明確報道。我們的研究團(tuán)隊首次發(fā)現(xiàn)：新近報道的線粒體鈣離子攝取關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子MCUR1，促進(jìn)肝癌細(xì)胞粒體鈣穩(wěn)態(tài)攝取，其表達(dá)水平在肝癌組織細(xì)胞中異常升高，MCUR1高表達(dá)能夠通過加速細(xì)胞增殖抑制線粒體依賴的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡

2、而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的生長能力，并且與肝癌病人的不良預(yù)后相關(guān)。文獻(xiàn)報道，線粒體的鈣離子環(huán)境是調(diào)控細(xì)胞活性氧 ROS生成的關(guān)鍵因素，而活性氧ROS作為胞內(nèi)重要的第二信使，能夠激活包括與腫瘤細(xì)胞增殖，凋亡，轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的血管生成相關(guān)的多種關(guān)鍵信號通路，最終導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MCUR1介導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑導(dǎo)致肝癌細(xì)胞活性氧ROS水平上調(diào)，這一改變與其下游P53降解，AKT/MDM2信號通路活化密切相關(guān)?；诖?，我們提出假說：

3、MCUR1上調(diào)引發(fā)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑，通過調(diào)控胞內(nèi)第二信使ROS生成影響其下游AKT/MDM2介導(dǎo)的P53降解信號通路，最終促進(jìn)肝癌的惡性進(jìn)展。
　　【目的】
　　本課題以肝癌為研究對象，選擇線粒體鈣離子攝取關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子MCUR1，明確MCUR1介導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑是否參與對肝癌生長的調(diào)控，并探索MCUR1介導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑調(diào)控肝癌生長的作用機(jī)制。
　　【方法】
　　1.利用免疫組化實驗分析MCUR1以及P5

4、3在原發(fā)性肝癌臨床標(biāo)本的表達(dá)及相關(guān)性。
　　2.利用MTS法測定細(xì)胞生長曲線、克隆形成實驗、Annexin-V凋亡檢測、流式細(xì)胞周期檢測、EdU細(xì)胞增殖等實驗方法，分析MCUR1對肝癌細(xì)胞增殖凋亡及生長的影響。
　　3.利用裸鼠皮下荷瘤實驗，分析MCUR1在體內(nèi)對肝癌生長的影響。
　　4.利用Rhod-2, Fluo-4活細(xì)胞染色，分析MCUR1對肝癌細(xì)胞線粒體基礎(chǔ)鈣離子水平以及線粒體對胞漿鈣的緩沖作用的影響。

5、　　5.利用DCF及MitoSox染料對細(xì)胞ROS及線粒體ROS進(jìn)行染色，分析MCUR1對肝癌細(xì)胞線粒體ROS生成的影響。
　　6.利用WesternBlot檢測凋亡相關(guān)分子，以及增殖相關(guān)分子的表達(dá)改變，分析MCUR1介導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長的作用機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　第一部分：通過對原發(fā)性肝癌臨床標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MCUR1在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，與肝癌不良預(yù)后相關(guān)。通過采用MTS法測定細(xì)胞生長曲線

6、、克隆形成實驗、Annexin-V凋亡檢測、流式細(xì)胞周期檢測、EdU細(xì)胞增殖等實驗方法，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中MCUR1通過抑制細(xì)胞凋亡并且加速細(xì)胞增殖而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。通過進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤實驗，證實MCUR1通過抑制肝癌凋亡，加速肝癌增殖，而促進(jìn)肝癌的生長。
　　第二部分：通過Rhod-2, Fluo-4染色檢測線粒體鈣以及胞漿鈣，發(fā)現(xiàn)：MCUR1能夠促進(jìn)線粒體鈣離子攝入，提升線粒體基礎(chǔ)鈣離子濃度，并且在應(yīng)急狀態(tài)下線粒體對胞漿鈣的緩

7、沖力。通過對線粒體單向轉(zhuǎn)運體MCU進(jìn)行干預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)MCUR1依賴于MCU促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體鈣的攝取。
　　第三部分：通過對細(xì)胞ROS以及線粒體ROS的檢測，發(fā)現(xiàn)MCUR1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體ROS生成。通過線粒體的ROS清除劑Mito-TEMPO對細(xì)胞中線粒體ROS進(jìn)行清除，以及線粒體鈣清除載體PV-Mito對線粒體內(nèi)的鈣離子進(jìn)行清除，發(fā)現(xiàn)MCUR1介導(dǎo)的線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)重塑通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體ROS生成，而抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)