環(huán)境雌激素MEHP通過ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在TRALI中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　輸血相關(guān)急性肺損傷（TRALI）是一種罕見但可能致命的輸血反應(yīng)，是目前輸血相關(guān)死亡的首要原因。盡管TRALI的危害已經(jīng)被人逐漸認(rèn)識到，但對這種并發(fā)癥的重視程度仍尚顯不夠。目前TRALI的診斷根據(jù)臨床癥狀主要是輸血后6小時內(nèi)發(fā)生急性呼吸窘迫的非心源性肺水腫。TRALI的病理生理機(jī)制第一步涉及輸血血液成分中含有獻(xiàn)血者血漿中存在的白細(xì)胞的抗體，其中最常見的是人類白細(xì)胞抗體（HLA）I類和II型抗體。第二步機(jī)制涉及到

2、中性粒細(xì)胞底物激活的肺生物活性因子造成直接肺血管內(nèi)皮損害，毛細(xì)血管滲漏和急性肺損傷。無論哪種機(jī)制，最后釋放哪種因子最后都是直接作用于肺血管內(nèi)皮從而引起輸血相關(guān)急性肺損傷。
　　鄰苯二甲酸二乙基已酯(DEHP)及代謝產(chǎn)物鄰苯二酸-單2乙基己酯(MEHP)是環(huán)境雌激素（EEs）中鄰苯二甲酸酯類（PAEs）的一種，被大量應(yīng)用于聚氯乙烯塑料制品中，是在環(huán)境中廣泛存在，可以在人類羊水，臍帶血，人類乳汁，精液，唾液檢測到。
　　根據(jù)美國

3、Swedish醫(yī)療中心2009年的一份研究報(bào)告顯示：在使用血液袋，輸液袋等含鄰苯二甲酸酯的醫(yī)療器械時，血液袋內(nèi)容物中脫落的DEHP及MEHP可以經(jīng)靜脈內(nèi)給藥而直接吸收。使用液相色譜/質(zhì)譜（LCMS）技術(shù)檢測獻(xiàn)血中心有效期內(nèi)第1天至第42天輸血袋上清液中的DEHP和MEHP含量顯示：DEHP的含量從第1天的34.3μM（20.0±SD）顯著增加至第42天的433.2μM（131.2±SD）；MEHP顯著從第1天的3.7μM（2.8±SD）

4、增加至第42天的74.0μM（19.1±SD）。由此可見使用庫血制品中含量超標(biāo)的的DEHP和MEHP可能是輸血相關(guān)急性肺損傷（TRALI）發(fā)生的一個重要因素。
　　細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞生物學(xué)在過去的10年研究最多的領(lǐng)域之一，是細(xì)胞程序性死亡的主要的研究形式，它在組織穩(wěn)態(tài)發(fā)展過程中的核心作用[8-14]。其中細(xì)胞凋亡的眾多信號通路中，Bcl-2家族蛋白是主要參與者。它們的主要功能是調(diào)節(jié)線粒體外膜（OMM）的通透性，釋放不同的凋亡因子，即

5、細(xì)胞色素C，Smac/DIABLO，Omi/HtrA2，核酸內(nèi)切酶g，和AIF。Bax作為促凋亡蛋白與鑒定為抗凋亡蛋白的Bcl-2蛋白，同屬Bcl-2家族。
　　N-乙?；腚装彼?NAC)在谷胱甘肽形成的時候起著重要作用，它直接影響了萃取蛋白質(zhì)的能力,被認(rèn)為是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，可以減輕細(xì)胞損傷作用。
　　為了探究MEHP（DEHP在人體內(nèi)會轉(zhuǎn)化生成MEHP）導(dǎo)致輸血相關(guān)急性肺損傷（TRALI）發(fā)生的原因和機(jī)制，我們建立體

6、外細(xì)胞染毒模型，探討MEHP對血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的直接毒效應(yīng)及其機(jī)制。
　　試驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、將HUVEC細(xì)胞在含10％胎牛血清濃度的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，用不同濃度的MEHP（0、6.25、12.5、25、50、100μM）染毒一定時間。
　　2、用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率以檢測MEHP對細(xì)胞的毒性作用。
　　3、用DCFH-D

7、A熒光探針、JC-1熒光探針等分別檢測細(xì)胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生以及線粒體膜電位的變化。
　　4、用試劑盒檢測細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)包括胞內(nèi)丙二醛（MDA）水平、谷胱甘肽（GSH）含量以及超氧化物歧化酶(SOD）酶活力的情況。
　　5、用酶標(biāo)學(xué)的方法檢測細(xì)胞凋亡可能存在的凋亡通路，檢測caspase-3、caspase-8、caspase-9三種酶的活力以驗(yàn)證內(nèi)源性和外源性凋亡通路。
　　6、用實(shí)時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞裂

8、解液中Bax，Bcl-2的含量。
　　7、Western blot檢測細(xì)胞裂解液中Bax，Bcl-2，細(xì)胞色素-c蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　8、利用用還原劑NAC預(yù)處理后，通過檢測ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞活力和凋亡率，看ROS是否介導(dǎo)了MEHP的毒效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞活力顯著下降，細(xì)胞活力呈劑量和時間依賴性下降。
　　2、細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，隨著濃度的增加，中、高劑量組胞內(nèi)ROS的含量明顯增加。

9、　　3、MEHP誘導(dǎo)HUVEC凋亡而導(dǎo)致胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)紊亂。
　　4、MEHP通過內(nèi)源性和外源性途徑共同誘導(dǎo)HUVEC凋亡。
　　5、MEHP可以引起細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2mRNA水平的改變。
　　6、HUVEC細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平Bax與Bcl-2比值隨著MEHP濃度增加而增加呈劑量依賴性，提示胞內(nèi)促細(xì)胞凋亡的存在，而NAC孵育后可以減輕細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　MEHP誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體的損傷