CPS1 報告體系的建立及其在肝細(xì)胞功能調(diào)控中的應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)的任務(wù)是，以部隊群體為主要的研究與保障對象，運用宏觀與微觀相結(jié)合的方法，研究武器裝備、軍事環(huán)境、軍事作業(yè)和其它有關(guān)因素，比如，作業(yè)環(huán)境、作業(yè)方式、生活方式、生物遺傳等，對軍隊人員健康的影響和所致傷害及其防護(hù)、預(yù)防與控制傷病的發(fā)生與流行，促進(jìn)成員身心健康、提高戰(zhàn)斗力。肝臟是人體最大的解毒器官，對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化作用，通過新陳代謝將它們徹底分解或

2、以原形排出體外。但肝臟很容易受特殊條件下生活方式、心理因素以及生物化學(xué)戰(zhàn)劑如布魯氏桿菌、肉毒桿菌毒素等的影響，患上如甲型或乙型肝炎、中毒性肝炎、或是肝硬化等疾病，在人口密度較高的軍隊集中爆發(fā)，危害肝臟健康，產(chǎn)生致命的傷害，影響作戰(zhàn)能力。我國是肝病大國，患病人口多，基數(shù)大，且病程長，病死率高，將會在很大程度上影響我國國民身體素質(zhì)，對我國國防力量建設(shè)產(chǎn)生影響。肝衰竭仍然是一個急劇性的、不可預(yù)知的疾病，具有從60％到90%不等的高死亡率。許多

3、研究表明，肝衰竭是由于大量的肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致廣泛的有毒物質(zhì)在血液積累使得肝臟功能急性衰退。肝性腦病，是一種嚴(yán)重的神經(jīng)精神并發(fā)癥的急性和慢性肝衰竭，與氨濃度劇烈升高有密切關(guān)系。現(xiàn)在肝衰竭的治療主要是基于減少氨產(chǎn)生、增加氨在腸道吸收的原則，多通過利福昔明和乳果糖起作用的。原位肝移植是肝衰竭有效的治療方法，但是現(xiàn)在能夠用于移植的肝臟數(shù)量有限，而人工肝可為患者提供部分營養(yǎng)需求并幫助患者清除體內(nèi)的有害物質(zhì)，是肝臟移植的有效替代治療方法。新鮮分離出的

4、人原代肝臟細(xì)胞是用于藥物研發(fā)、臨床研究以及生物人工肝的最理想的細(xì)胞來源，但是由于肝臟供體的嚴(yán)重稀缺及很難在體外維持細(xì)胞功能等特點，使之不能擴(kuò)大應(yīng)用范圍；而其他細(xì)胞構(gòu)成的分析模型，如動物來源的原代肝臟細(xì)胞，或人肝癌細(xì)胞系，其功能皆不能和正常人肝細(xì)胞相比擬，因為它們與人原代肝細(xì)胞往往呈指數(shù)級差異；干細(xì)胞是具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞，且由于它的低免疫原性，臨床使用過程中并沒有明顯的副作用和不良反應(yīng)，因此醫(yī)學(xué)界將其稱為“萬用細(xì)胞”，而

5、被認(rèn)為是生物人工肝理想的種子細(xì)胞，基于近年來各國諸多科學(xué)家的研究，使干細(xì)胞肝向誘導(dǎo)分化所得的肝細(xì)胞最接近正常人原代肝細(xì)胞，但是目前遇到的瓶頸問題是，這類在體外定向分化獲得的肝細(xì)胞，可能不會表現(xiàn)出完善的功能，出現(xiàn)不能很好地表達(dá)成熟肝細(xì)胞所特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)的現(xiàn)象，而又或者是功能成熟的細(xì)胞數(shù)量很少，很難大規(guī)模應(yīng)用。肝臟是人體的一個巨大的“化工廠”，承擔(dān)著人體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)、脂類等多種物質(zhì)代謝，合成膽汁、白蛋白，進(jìn)行解毒、免疫、產(chǎn)生凝血

6、因子、維持電解質(zhì)平衡等諸多功能。因此，維持人工肝內(nèi)所使用肝細(xì)胞的功能對于晚期肝病患者的治療至關(guān)重要。我們以解氨毒為例，期望能夠獲得足夠的具有高效解氨毒能力的細(xì)胞，并且能夠在體外操作，通過直觀觀察即能評價其功能的體系。由于終末期肝病患者往往伴隨著高血氨癥致的肝性腦病，而氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ（CPS1），是尿素循環(huán)的限速酶，它存在于肝細(xì)胞的線粒體中，促進(jìn)將有毒的游離氨轉(zhuǎn)換成無毒產(chǎn)物尿素，而氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ的這種轉(zhuǎn)化能力作為成熟肝細(xì)胞功能

7、的指標(biāo)，不僅提示我們誘導(dǎo)CPS1表達(dá)的小分子化合物可能具有提高肝細(xì)胞的其他功能的作用，還有可能，那些能使CPS1功能降低或缺失的小分子化合物，會使細(xì)胞形態(tài)及性狀發(fā)生改變，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞命運。由于終末分化的體細(xì)胞可以通過強(qiáng)制表達(dá)一些特異的轉(zhuǎn)錄因子而被重編程為多能干細(xì)胞，表明細(xì)胞的命運是可逆轉(zhuǎn)的，且不同譜系特異的轉(zhuǎn)錄因子的組合還可以直接將人和鼠的體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，肝細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，為疾病模型的構(gòu)建及再生醫(yī)學(xué)提供了可供選擇的途徑。與基因重組因

8、子相比，化學(xué)方法使用的小分子化合物具有細(xì)胞滲透性，易于合成、保護(hù)以及規(guī)范化，同時這種方法還具有可塑性。此外，研究者還可通過控制小分子化合物的濃度和持續(xù)時間來微調(diào)整個過程?；瘜W(xué)方法通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)多個信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和特殊基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，繞開了其他細(xì)胞重編程方法帶來的技術(shù)問題和安全問題，給那些被傳統(tǒng)治療方法認(rèn)為是“不治之癥”的疾病治療帶去希望。
　　目的：
　　目前主要的挑戰(zhàn)是如何獲得足夠可用

9、于生物人工肝進(jìn)行體外解毒的細(xì)胞，尤其是針對清除體內(nèi)游離氨而提高生物人工肝在臨床使用的效果，并且能在體外操作，通過直觀觀察即能評價體外分化的肝臟細(xì)胞成熟情況的有效篩選體系；并以此為基礎(chǔ)，優(yōu)化已發(fā)現(xiàn)的有效藥物對肝細(xì)胞作用的條件，進(jìn)一步提高藥物作用效率并減少對肝細(xì)胞的損傷。
　　方法：
　　利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建靶向CPS1的sgRNA及打靶載體，分別用試劑轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞系HepG2、正常人肝細(xì)胞永生化細(xì)胞系LO

10、2以及人胚胎干細(xì)胞；用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢驗篩選得到細(xì)胞的DNA片段；用流式對基因編輯過的細(xì)胞進(jìn)行分群；用免疫熒光進(jìn)行靶蛋白定位、篩選及鑒定；通過實時定量PCR分析不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞克隆的肝功能相關(guān)基因的表達(dá)情況；利用相應(yīng)的試劑盒對不同熒光強(qiáng)度細(xì)胞克隆的白蛋白分泌量、CYP3A4酶活性、氨清除能力以及尿素生成能力進(jìn)行檢測分析；利用高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)對不同藥物及不同藥物濃度對細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響進(jìn)行統(tǒng)計分析；利用CCK8試劑盒檢測不同藥物及不同藥

11、物濃度對細(xì)胞的毒性；Western Blotting分析白藜蘆醇及siCPS1處理后細(xì)胞中氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ蛋白水平的變化；觀察LO2細(xì)胞克隆形態(tài)以評價藥物對細(xì)胞的影響，初步探討其可能誘導(dǎo)重編程的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　基因測序顯示打靶載體構(gòu)建正確；用打靶載體中的增強(qiáng)型紅色熒光蛋白（tdTomato）標(biāo)記CPS1基因后的HepG2、LO2細(xì)胞以及人胚胎干細(xì)胞經(jīng)過G418篩選，自發(fā)表達(dá)紅色熒光蛋白；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PC

12、R擴(kuò)增細(xì)胞DNA片段，目的條帶大小正確；通過流式分選獲得不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞，且經(jīng)過免疫熒光染色對靶蛋白定位后，獲得在線粒體中表達(dá)CPS1蛋白的細(xì)胞克隆，5個HepG2-CPS1-2atdTomato細(xì)胞克隆，4個LO2-CPS1-2atdTomato細(xì)胞克隆。實驗結(jié)果顯示不同熒光強(qiáng)度的HepG2細(xì)胞克隆和LO2細(xì)胞克隆，其CPS1、AAT、ALB、CYP450家族、TF基因表達(dá)水平不同，且其白蛋白分泌量，CYP3A4酶活性，氨清除能力以

13、及尿素生成能力不同，并且呈正相關(guān)性。因此，我們可在此基礎(chǔ)上通過直觀觀察熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)或減弱而篩選小分子化合物，其中苯丁酸鈉和白藜蘆醇能夠顯著提高細(xì)胞熒光強(qiáng)度、CPS1基因表達(dá)水平、氨清除能力和尿素生成能力，除此之外，還有效地提高了AAT、ALB、TF、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、C/EBPα、HNF4α、FOXO3a等功能基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平；白藜蘆醇和siCPS1在分別增強(qiáng)和抑制了CPS1的基因、蛋白表達(dá)水平的基礎(chǔ)上

14、，也分別增強(qiáng)和抑制了細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度；當(dāng)紅色熒光蛋白標(biāo)記了CPS1的胚胎干細(xì)胞肝向誘導(dǎo)至成熟階段，線粒體紅色熒光蛋白開始表達(dá)；減弱了LO2細(xì)胞中紅色熒光蛋白強(qiáng)度的小分子化合物，還能在長期無血清的細(xì)胞培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)及性狀改變，干性基因表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論：
　　基于CRISPR/Cas技術(shù)的基因打靶，建立CPS1-2atdTomato肝細(xì)胞系HepG2和LO2、胚胎干細(xì)胞報告細(xì)胞體系，結(jié)合細(xì)胞影像能夠篩選調(diào)控細(xì)胞

15、命運的小分子化合物，與人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化體系或是誘導(dǎo)分化成熟的體細(xì)胞重編程恢復(fù)多功能干性的體系結(jié)合，可以成為在體外獲得穩(wěn)定代謝功能的人肝細(xì)胞的可靠篩選模型，為以后提供供體細(xì)胞、建立人源化動物模型在體研究和應(yīng)用分化的干細(xì)胞進(jìn)行體外藥物篩選都具有著十分重要的意義，而且用這樣的評價體系得到的肝臟細(xì)胞若具有和人成體肝臟細(xì)胞相類似的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，那么我們便可以用這個體系篩選出來的細(xì)胞做為藥物開發(fā)中檢測肝臟毒性、藥物相互