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文檔簡介
1、目的:脂肪細(xì)胞在能量儲(chǔ)存和代謝中發(fā)揮著重要的作用,由其所分泌的不同因子具有影響食欲、胰島素敏感性、炎癥反應(yīng)以及其他生物學(xué)通路的作用,具有重要臨床意義。肥胖,是慢性代謝綜合癥的主要病因之一,機(jī)體通常處于慢性氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。然而,活性氧在肥胖的發(fā)生發(fā)展中的作用卻一直不清。核轉(zhuǎn)錄因子NE-E2相關(guān)因子(Nrfs)是啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子,屬于CNC家族的堿性亮氨酸拉鏈蛋白。在本研究組最新的研究中已證實(shí),Nrf2可以通過調(diào)控PPARγ
2、的表達(dá)而影響脂肪細(xì)胞的形成過程,鑒于Nrf1在結(jié)構(gòu)以及在調(diào)控抗氧化酶基因等功能上與Nrf2的相似,以及在不同器官中的獨(dú)特作用,我們認(rèn)為其在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過程中極可能存在與Nrf2相似的功能。因此,我們用含有針對小鼠Nrf1基因的sh-RNA慢病毒,感染小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系,建立小鼠Nrf1基因沉默的前脂肪細(xì)胞系,并進(jìn)一步研究該基因在脂肪細(xì)胞分化和脂肪代謝過程中的作用。
砷及其化合物是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確
3、認(rèn)的人類致癌物。長期飲用高砷水除可導(dǎo)致砷性皮膚損傷及皮膚癌、內(nèi)臟腫瘤、心血管疾病外,近年來的流行病學(xué)發(fā)現(xiàn),砷中毒還可以導(dǎo)致糖尿病的高發(fā)。那么,低濃度砷長期暴露是否可以導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞胰島素敏感性下降,即胰島素抵抗,目前,還沒有相關(guān)機(jī)制研究。因此,在本研究中,我們試圖探討低濃度的砷是否可以通過對Nrf1或Nrf2的調(diào)控而激活抗氧化酶,進(jìn)而抑制胰島素刺激脂肪細(xì)胞糖攝取所依賴的ROS信號(hào)傳導(dǎo)通路,而導(dǎo)致胰島素抵抗。
方法:
4、> 1、研究對象
1)細(xì)胞培養(yǎng)
小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞系購至ATCC。培養(yǎng)時(shí)應(yīng)用含有10%小牛血清(CS)、50 units/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2,95%大氣條件下培養(yǎng)。
2)細(xì)胞分化
分化誘導(dǎo)劑為:地塞米松(Dexamethasone,簡寫為Dex)、異丁基甲基黃嘌呤(Isobutylmethylxanthine,簡寫
5、為IBMX)和胰島素(Insulin),上述三者組合而成的誘導(dǎo)劑簡稱為“DMI”。此外,為加快細(xì)胞的分化速度,還可以向DMI中補(bǔ)充添加羅格列酮(Rosiglitazone,簡寫為Rosi)和吲哚美辛(Indomethacin,簡寫為Indo)。上述五種誘導(dǎo)劑的組合可簡稱為“DMIRI”或“All”。含有分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基稱為“分化培養(yǎng)基”。
2、建立Nrf1沉默的3T3L1細(xì)胞系MISSION短發(fā)卡RNA(shRNA)慢病
6、毒顆粒購于Sigma。按產(chǎn)品手冊將針對基因Nrf1(SHVRS-NM-008686)或非針對性的Scramble陰性對照(Scr,SHC002V)的顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞系。轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時(shí),細(xì)胞以40-50%的融合率被接種于6孔板。次日,以每孔8μg/ml和2×105TU(Transducing Units,傳導(dǎo)單位)的濃度向細(xì)胞中分別添加海美溴銨(Hexadimethrine bromide)和病毒顆粒。隔夜孵育后,將含有
7、病毒顆粒的培養(yǎng)基換為含有2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)的新鮮培養(yǎng)基,對細(xì)胞進(jìn)行篩選,建立Nrf1基因沉默和Scr穩(wěn)定傳染的細(xì)胞模型。待細(xì)胞達(dá)到90%融合后,用含有puromycin的培養(yǎng)基將其傳代。其中,在進(jìn)行傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)之前,先確定于3-5天內(nèi)可將全部細(xì)胞殺死的puromycin的濃度。
3、油紅染色(Oil-red Stainning)油紅染色步驟如下:將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去,冷PBS沖洗細(xì)胞3次,于10%中性緩沖福
8、爾馬林(10%neutral-buffered formalin)中固定5分鐘,冷PBS再次沖洗細(xì)胞3次,并于搖床上連續(xù)沖洗5分鐘,其間換液2次。棄去PBS后于油紅染料中染色30分鐘,而后用PBS再次沖洗細(xì)胞,上掃描儀掃描。
4、蛋白提取、定量與Western Blot免疫印跡法(Western blot)檢測上述基因的蛋白表達(dá)情況:收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞后,提取總蛋白。核蛋白提取按照試劑盒說明書進(jìn)行,提取后置于-80℃保存。
9、調(diào)整總蛋白或核蛋白濃度一致,進(jìn)行蛋白電泳。蛋白電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,封閉后分別加入適當(dāng)比例稀釋的一抗雜交,然后加入各自相應(yīng)的二抗再次雜交。
5、mRNA提取與定量Real-time PCR分析應(yīng)用TRIzol(invitrogen)法進(jìn)行細(xì)胞總mRNA提取。定量Real time PCR操作方法主要步驟如下,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):總RNA經(jīng)MuLV反轉(zhuǎn)錄酶和OligodT,dNTP轉(zhuǎn)錄為cDNA。充分混合后,首先經(jīng)25℃
10、,10 min;48℃,60 min合成cDNA,然后于95℃加熱5min,終止反應(yīng),4℃?zhèn)溆?。使用SYBR Green試劑盒(Applied Biosystem)進(jìn)行Real-time PCR分析。
6、急性細(xì)胞毒性檢測(MTT)細(xì)胞按每孔5×104濃度接種于96孔板內(nèi),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁24小時(shí),之后倒掉培養(yǎng)液,用含有不同濃度亞砷酸鈉(5-50μM)的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24或48小時(shí),之后用非放射活性細(xì)胞增值試劑盒(
11、G5430,美國Promega公司)檢測細(xì)胞活力,結(jié)果用砷暴露組與對照組(不含砷的培養(yǎng)液)的百分比表示,同時(shí)制作細(xì)胞活性線性圖形,并記錄LC50(細(xì)胞的半數(shù)致死劑量)。比較3T3L1細(xì)胞Nrf1基因沉默對砷誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的反應(yīng)。
7、胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)AKT磷酸化實(shí)驗(yàn)(pAKT-Ser407)與[3H]-2-脫氧葡萄糖攝取([3H]-2-deoxy-D-glucose uptake)實(shí)驗(yàn)被用于亞砷酸鈉處理的成熟脂肪細(xì)胞的胰島素
12、敏感性實(shí)驗(yàn)。
8、細(xì)胞內(nèi)GSH表達(dá)水平的測定應(yīng)用BIOXYTECH GSH/GSSG-412試劑盒(Oxis Research)進(jìn)行總GSH(Glutathione)與GSSG(Glutathion disulfide)分析。
9、統(tǒng)計(jì)與分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析與制圖。用單因素方差分析(ANOVA)比較各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來自3個(gè)以上平行樣品或3次以上重復(fù)
13、實(shí)驗(yàn),以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。
結(jié)果:
1、建立Nrf1基因沉默小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞系Real time-PCR結(jié)果顯示成功建立了Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A細(xì)胞系與sh-Nrf1-L細(xì)胞系。
2、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)分析對sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)進(jìn)行分析,Nrf1全型基因沉默可以顯著降低細(xì)胞
14、中Gclc、Gclm、Nqo1的基因的表達(dá),而不改變HO1的表達(dá):Nrf1長型基因沉默可以降低Gclc、Nqo1的基因的表達(dá),而不改變Gclm、HO1的表達(dá)。
3、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞急性細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)經(jīng)5-50μM和5-35μM亞砷酸鈉染毒24、48小時(shí)后,3種細(xì)胞活力均隨著亞砷酸鈉濃度的增高而逐漸變低,其中Nrf1基因沉默細(xì)胞(sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞)對砷暴露表現(xiàn)出敏感性。
15、> 4、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞Nrf1蛋白表達(dá)Western結(jié)果顯示Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞系相應(yīng)的被沉默的Nrf1蛋白,表達(dá)均顯著降低。
5、sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)分析sh-Nrf1-A與sh-Nrf1-L細(xì)胞的Cebpα、δ、Pparγ、Pparγ1和Pparγ2的基因表達(dá)均高于對照Scramble細(xì)胞
16、、sh-Nrf1-A細(xì)胞的Cebpβ的基因表達(dá)高于對照Scramble細(xì)胞。
6、Nrf1基因沉默3T3L1細(xì)胞的分化能力油紅染色顯示,Nrf1全型和長型基因沉默的sh-Nrf1-A細(xì)胞系與sh-Nrf1-L細(xì)胞系分化能力增強(qiáng)。
7、sh-Nrf1-L細(xì)胞分化7天、24小時(shí)和8小時(shí)過程中脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因與蛋白的變化Real time-PCR與Western結(jié)果顯示sh-Nrf1-L細(xì)胞分化7天、24小時(shí)和
17、8小時(shí)過程中,其Pparγ的表達(dá)均高于Scramble對照細(xì)胞。
8、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可降低成熟脂肪細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取,并呈現(xiàn)時(shí)間、劑量-效應(yīng)。
9、砷致脂肪細(xì)胞ROS的產(chǎn)生長期低劑量亞砷酸鈉暴露可增加成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)。
10、砷致脂肪細(xì)胞抗氧化基因與蛋白的表達(dá)長期低劑量亞砷酸鈉暴露可增加成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化酶的基
18、因和蛋白水平的表達(dá),并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。
11、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞GSH含量的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露不改變成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)GSH的含量。
12、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞Nrf1與Nrf2基因與蛋白表達(dá)的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可以增加Nrf2基因與蛋白的表達(dá),而不改變Nrf1基因的表達(dá),并降低Nrf1蛋白的表達(dá)。
13、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞分化與炎性介質(zhì)基因表達(dá)的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可
19、以降低Cebpα、Pparγ1和Pparγ2的基因表達(dá),并增高炎性介質(zhì)Tnf-α、IL-6、IL-1β、iNos和Cox-2的基因表達(dá)。
14、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞IRS-1-p-AKT通路的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露可以增強(qiáng)基礎(chǔ)水平的p-IRS1-Ser307和p-AKT-Ser473蛋白的表達(dá),降低基礎(chǔ)水平的p-PI3K的蛋白表達(dá),使成熟脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性下降。
15、長期砷暴露對脂肪細(xì)胞Glut1與
20、Glut4 mRNA表達(dá)的影響長期低劑量亞砷酸鈉暴露不改變基礎(chǔ)水平的Glut1基因表達(dá),而降低Glut4表達(dá)。
結(jié)論:
1、成功獲得Nrf1全型和長型基因沉默的小鼠3T3L1前脂肪細(xì)胞模型,且核轉(zhuǎn)錄因子Nrf1參與調(diào)控抗氧化酶和分化相關(guān)基因的表達(dá)。
2、Nrf1基因沉默可通過提高前脂肪細(xì)胞中Pparγ的表達(dá)而增強(qiáng)分化。
3、長期低劑量亞砷酸鈉暴露通過提高抗氧化酶的表達(dá)而抑制胰島素刺
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