與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)人ES細(xì)胞向造血分化體系的研究.pdf

1、背景：
　　造血干細(xì)胞（HSC）是所有脊椎動(dòng)物造血細(xì)胞形成的中心環(huán)節(jié)，移植后可完全重建造血功能，因此，同種異體造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是治療許多血液疾?。ㄈ绨籽?、地中海貧血、血液腫瘤）的關(guān)鍵。臨床上，成體造血干細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓及臍帶血，而由于來(lái)源受限及免疫排斥極大地阻礙了造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。胚胎干細(xì)胞(ES)為一類(lèi)多能干細(xì)胞，在體外可無(wú)限擴(kuò)增，且在特定條件下具有向造血干細(xì)胞分化的潛能，解決了細(xì)胞來(lái)源受限、免疫排斥

2、等問(wèn)題，為人類(lèi)再生醫(yī)學(xué)和個(gè)體化細(xì)胞替代療法提供了無(wú)限的細(xì)胞來(lái)源。
　　ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)造血分化的研究是較為深入的領(lǐng)域之一。其中，OP9細(xì)胞是常用的用于誘導(dǎo)造血分化的基質(zhì)細(xì)胞系，傳統(tǒng)的共培養(yǎng)誘導(dǎo)周期約為2-3周，耗時(shí)長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)選用該誘導(dǎo)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)探究最佳OP9細(xì)胞的接種密度，以達(dá)到縮短誘導(dǎo)分化周期的目的，優(yōu)化體外造血分化體系。通過(guò)體外誘導(dǎo)造血分化的技術(shù)，建立人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)造血分化的平臺(tái)，為干細(xì)胞治療奠定基礎(chǔ)，也為研究造

3、血細(xì)胞的發(fā)生生育的調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)。
　　目的：
　　探索OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化的最優(yōu)條件，為體外誘導(dǎo)分化及機(jī)制研究建立平臺(tái)。
　　方法：
　　傳統(tǒng)的與小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞OP9細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化，OP9細(xì)胞前期培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化過(guò)程的周期約為2-3周，我們利用本實(shí)驗(yàn)室已建系的人胚胎干細(xì)胞株HN14，將OP9細(xì)胞設(shè)置成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組：OP9細(xì)胞密度設(shè)置6個(gè)梯度即1.5，2.5，3.5，5.0，6.5，

4、8.0×105/ml接種至10cm皿培養(yǎng)24h后，即與HN14共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化；對(duì)照組：應(yīng)用傳統(tǒng)方法，將OP9細(xì)胞按1.5×105/ml接種培養(yǎng)4天后，達(dá)到融合狀態(tài)后進(jìn)行共培養(yǎng)。通過(guò)觀察形態(tài)變化、流式檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及集落形成實(shí)驗(yàn)比較造血分化的效率。
　　結(jié)果：
　　無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，鏡下觀察，ES細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度地分化。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)過(guò)程中第8、10、12天的CD34細(xì)胞陽(yáng)性率，對(duì)照組在第12天

5、達(dá)高峰，CD34的陽(yáng)性率達(dá)10％左右，相較而言，在實(shí)驗(yàn)組中，CD34的陽(yáng)性率提前2天達(dá)高峰，即在共培養(yǎng)第10天達(dá)高峰，且分化效率與對(duì)照組無(wú)差異（P值＞0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，中胚層的標(biāo)志性基因BRACHYURY，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在對(duì)照組在第6天達(dá)高峰，而實(shí)驗(yàn)組在第4天表達(dá)達(dá)高峰，這與CD34的表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間相一致。磁珠分選CD34+細(xì)胞進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其具有向各系造血祖細(xì)胞分化的能力。本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

6、，與傳統(tǒng)的OP9細(xì)胞需培養(yǎng)4天后進(jìn)行共培養(yǎng)的方法相比，以5.0-6.5×105/ml密度接種OP9細(xì)胞培養(yǎng)僅24h，共培養(yǎng)10天即可達(dá)到與對(duì)照組相似的分化效率，使誘導(dǎo)分化的周期足足縮短了3-5天，大大提高了分化效率。
　　結(jié)論：
　　1．利用與小鼠OP9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)體系，在本實(shí)驗(yàn)室建立了體外誘導(dǎo)造血分化的平臺(tái)，為之后的機(jī)制性研究實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　2．探究最佳OP9細(xì)胞接種密度，以5.0-6.5×105/ml接