體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為汗腺細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能的研究
　　 目的：獲得高純度的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察體外培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、多分化潛能，探討作為種子細(xì)胞修復(fù)與重建皮膚的可能性。
　　 方法：取足月剖腹產(chǎn)手術(shù)的健康胎兒臍帶組織，分別用酶消化法和組織塊法獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 1.倒置顯微鏡觀察酶消化法和組織塊培養(yǎng)法獲得各代細(xì)胞的形態(tài)并拍照記錄。
　　 2.通過流式細(xì)胞技術(shù)鑒定人

2、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面特定標(biāo)志物；
　　 3.通過MTT法檢測第1、2、3、4代細(xì)胞的增殖狀況，并繪制生長曲線；
　　 4.通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測第2、4、6代細(xì)胞周期；
　　 5.通過HE組織化學(xué)染色法進(jìn)一步檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)狀況；
　　 6.通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的檢測進(jìn)一步鑒定細(xì)胞表面特定標(biāo)志物；
　　 7.通過異體淋巴細(xì)胞增殖實驗反映臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對異體淋巴細(xì)胞增殖的影響；

3、r>　　 8.通過透射電鏡觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；
　　 9.通過多向誘導(dǎo)分化實驗反應(yīng)人臍帶問充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為各種細(xì)胞的潛能。
　　 結(jié)果：
　　 1.倒置相差顯微鏡觀察到，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞呈梭形，橢圓形核，整體呈現(xiàn)漩渦狀增生；
　　 2.強烈的表達(dá)CD44、CD29、CD105、CD73、HLA-Ⅰ，不表達(dá)CD34、HLA-DR、CD45；
　　 3.MTT檢測各代細(xì)胞具

4、有共同特征，潛伏期1d后，均進(jìn)入對數(shù)增殖期，直至第7d達(dá)峰值，第9d各代細(xì)胞均受到不同濃度接觸性抑制；
　　 4.大部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均處于靜止期(G0 G1)，但隨著代數(shù)的增加，逐漸進(jìn)入增殖期(G2、S和M期)；
　　 5.HE組織化學(xué)檢測細(xì)胞呈梭形或多角形，部分可見核分裂象；
　　 6.熒光免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測細(xì)胞顯著表達(dá)CD90、CD44，不表達(dá)CD31、CD45；
　　 7.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與異

5、體淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)后，與PHA刺激的異體淋巴細(xì)胞增殖組比較，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抑制了異體淋巴細(xì)胞增殖，增殖轉(zhuǎn)化抑制率為70.2％，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；
　　 8.透射電鏡觀察該細(xì)胞的細(xì)胞核較大，且不規(guī)則，核仁明顯，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少，有少量細(xì)胞器；
　　 9.在體外特定誘導(dǎo)條件下，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為脂肪和成骨細(xì)胞，說明其具有多分化的誘導(dǎo)潛能。
　　 結(jié)論：利用酶消化法和組織塊培養(yǎng)法從Wha

6、rton膠中獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，對其生物學(xué)特性和誘導(dǎo)分化能力進(jìn)行一系列的研究后，結(jié)果表明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強的增殖能力、低免疫原性和向其他組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力，是組織工程皮膚構(gòu)建的較理想的種子細(xì)胞。
　　 第二部分人汗腺細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：獲得純化的人汗腺細(xì)胞。
　　 方法：取約1cm×2cm大小的全層正常皮膚組織，去除皮下脂肪，將皮膚剪碎至1mm×1mm×1mm大小，采用Ⅱ型膠原酶消化法

7、，溫箱培養(yǎng)24h。
　　 1.倒置顯微鏡觀察汗腺結(jié)構(gòu)；
　　 2.挑取清晰汗腺組織，繼續(xù)培養(yǎng)后，倒置顯微鏡觀察各代汗腺細(xì)胞的形態(tài)并拍照記錄；
　　 3.通過HE組織化學(xué)染色法進(jìn)一步檢測人汗腺細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)狀況；
　　 4.癌胚抗原(CEA)、角蛋白7和角蛋白18、19(CK7、CK18、CK19)鑒定汗腺細(xì)胞；
　　 結(jié)果：
　　 1.倒置顯微鏡觀察人汗腺結(jié)構(gòu)清晰，由盤曲狀和直行管狀結(jié)構(gòu)

8、組成。
　　 2.原代汗腺細(xì)胞(SGCs)第4天左右從汗腺結(jié)構(gòu)中游出，細(xì)胞呈扁平狀單層結(jié)構(gòu)；14d后SGCs迅速增殖，胞膜相互緊貼并如“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)；21d左右，約有80％-90％的融合，融合后的汗腺腺上皮細(xì)胞呈扁平多角形，中間有較大圓形核。
　　 3.HE染色法染色體外培養(yǎng)人汗腺細(xì)胞，細(xì)胞呈扁平多角形，中間細(xì)胞核大且呈圓形，類似眼睛。
　　 4.熒光免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測細(xì)胞顯著表達(dá)強烈表達(dá)癌胚抗原(CEA)、角

9、蛋白7和角蛋白18、19(CK7、CK18、CK19)。
　　 結(jié)論：利用Ⅱ型膠原酶消化結(jié)合顯微器械解剖法分離得到人汗腺，通過組織塊貼壁的體外原代培養(yǎng)方法，并反復(fù)去除成纖維細(xì)胞后，可以得到純化的人汗腺細(xì)胞。
　　 第三部分與人汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化
　　 目的：觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與熱損傷的人汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)時的轉(zhuǎn)化情況。
　　 方法：
　　 1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外B

10、rdU標(biāo)記，通過流式細(xì)胞技術(shù)鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　 2.通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測進(jìn)一步鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　 3.原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞達(dá)到80％-90％的融合后，放入47.0°C的環(huán)境中40min，造成汗腺細(xì)胞的體外的熱休克狀態(tài)，倒置顯微鏡觀察熱休克后汗腺細(xì)胞的形態(tài)并拍照記錄。
　　 4.將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與熱休克狀態(tài)的汗腺細(xì)胞共同培養(yǎng)。
　　 5.倒置顯微鏡下觀察兩個

11、細(xì)胞共培養(yǎng)后的形態(tài)學(xué)變化。
　　 6.采用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色法來檢測表型改變結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物BrdU呈強烈的表達(dá)。
　　 2.鏡下見大部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記后核抗BrdU染色陽性。
　　 3.倒置顯微鏡下觀察處于熱休克狀態(tài)的汗腺細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞脫離附壁，大多數(shù)細(xì)胞仍處于貼壁狀態(tài)，但由于細(xì)胞胞漿回縮，使得細(xì)胞間隙增寬，形態(tài)呈圓形改

12、變。
　　 4.共培養(yǎng)4h后，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁，且大多數(shù)貼于汗腺細(xì)胞間的空隙處；共培養(yǎng)2d，兩種細(xì)胞交錯共生；共培養(yǎng)4d，部分細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則，多核和異型核，融合細(xì)胞的胞核開始相互靠近，其間散落少量的壞死細(xì)胞。
　　 5.用角蛋白19(CK19)、CEA和BrdU的免疫熒光抗體來檢測共培養(yǎng)后的BrdU標(biāo)記的HUMSCs與SGCs，表現(xiàn)汗腺細(xì)胞單層有BrdU+摻入，部分BrdU+摻入的細(xì)胞，同時表達(dá)(CK19