BMP9通過(guò)MAPKs通路調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，其具有分化為成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。因此MSCs可以作為種子細(xì)胞，修復(fù)、重建受傷或發(fā)生病變的多種組織器官，目前在骨再生研究中得到廣泛應(yīng)用。但是，由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，因此尋找促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化的細(xì)胞因子是目前制約骨再生研究發(fā)展的瓶頸。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bo

2、ne morphogenetic proteins，BMPs）是研究最早和最有潛力的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子，其屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transform growtll factorβ，TGF-β）超家族的成員之一，目前共分離和鑒定了20余種BMFs，其中己報(bào)道的具有誘導(dǎo)成骨活性的BMFs主要為BMP2、4、6、7、9等，其中本課題組研究發(fā)現(xiàn)BMP9誘導(dǎo)成骨的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于傳統(tǒng)應(yīng)用的BMP2和BMP7，因此其有希望作為一種更強(qiáng)的促進(jìn)

3、細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子候選者而應(yīng)用于臨床。BMP9（也稱GDF-2，growth differentiation factor2）是BMPs中的一種，其具有多種生物學(xué)功能，但是對(duì)于BMP9在骨形成及骨再生中的作用及其機(jī)制了解很少。
　　 本研究的目的是：（1）BMP9是否能夠激活MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；（2）MAPKs信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用；（3）BMP9通過(guò)MAPKs信號(hào)通路調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分

4、化的可能作用機(jī)制。
　　 在本研究的第一部分，首先通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性的方法驗(yàn)證BMP9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。接下來(lái)，采用Western Blot的方法檢測(cè)BMP9刺激后MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白激酶p38MAPK、ERK1/2和JNK磷酸化水平的改變。但是，BMP9對(duì)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是否對(duì)其誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化具有影響，是接下來(lái)需要闡明的問(wèn)題。因此，使用p38MAPK的特異性抑制

5、劑SB203580和ERK1/2的特異性抑制劑PD98059分別抑制p38MAPK和ERK1/2的活性后，通過(guò)檢測(cè)成骨早期標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）活性研究其對(duì)BMP9誘導(dǎo)成骨分化的影響，結(jié)果顯示：（1）抑制p38MAPK的活性可降低BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2、C2C12和MC3T3-E1細(xì)胞的早期成骨分化，且SB203580的這種抑制作用呈劑量依賴性；（2）抑制ERK1/2的活性能夠增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2、C2C1

6、2和MC3T3-E1細(xì)胞的早期成骨作用。隨后，通過(guò)茜素紅S染色的方法檢測(cè)成骨晚期標(biāo)志鈣鹽沉積的改變，結(jié)果顯示：抑制p38MAPK的活性可降低BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的晚期成骨作用，而抑制ERK1/2的活性則能夠增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的晚期成骨作用。最后，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)成骨晚期標(biāo)志物骨橋蛋白（OPN）和骨鈣素（OCN）表達(dá)的變化，同樣結(jié)果顯示，抑制p38MAPK的活性可降低BMP9誘導(dǎo)的C3H10

7、T1/2細(xì)胞的成骨標(biāo)志物OPN和OCN的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而抑制ERK1/2的活性能夠增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的成骨標(biāo)志物OPN和OCN的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。綜上所述，抑制p38MAPK的活性可降低BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的早期及晚期成骨分化，而抑制ERK1/2的活性則能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的早期及晚期成骨分化。
　　 在本研究的第二部分，采用RNA干擾的方法抑制p38MAPK、ERK1和ERK2 mRNA的表達(dá)

8、，檢測(cè)其對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外及體內(nèi)成骨分化的影響。結(jié)果顯示：（1）降低p38MAPK的表達(dá)同樣可抑制BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的ALP活性；（2）減少ERK1和ERK2的表達(dá)能夠增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的ALP活性。接下來(lái)，將攜帶有sip38MAPK、siERK1和siERK2的腺病毒和表達(dá)BMP9的腺病毒共同感染C3H10T1/2細(xì)胞后進(jìn)行裸鼠皮下接種，檢測(cè)將p38MAPK、ERK1和ERK2的

9、基因沉默后其對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨的影響，結(jié)果表明：（1）細(xì)胞皮下接種5周后，各組均形成了質(zhì)地堅(jiān)硬的包塊，表明各組均形成了骨質(zhì)組織；（2）降低p38MAPK的表達(dá)對(duì)形成的骨組織的體積影響不大；而減少ERK1或ERK2的表達(dá)可增加形成的骨組織的體積。（3）HE染色結(jié)果顯示，減少p38MAPK表達(dá)能夠抑制形成的骨小梁數(shù)量、降低骨小梁形成的質(zhì)量，并且可見軟骨細(xì)胞存在；而降低ERK1或.ERK2的表達(dá)可明顯增加形成的骨小梁的數(shù)量，

10、且骨小梁結(jié)構(gòu)更加完整。（4）Alcian blue染色結(jié)果顯示，減少p38MAPK的表達(dá)能夠促進(jìn)被染成藍(lán)色的軟骨基質(zhì)的形成；而降低ERK1或ERK2的表達(dá)可明顯減少被染成藍(lán)色的軟骨基質(zhì)的形成。（5）Masson's Trichrome三色染色結(jié)果顯示，降低p38MAPK的表達(dá)能夠使染成紅色的骨基質(zhì)減少，而染成藍(lán)色的軟骨基質(zhì)增多；而減少ERK1或ERK2的表達(dá)可使染成紅色的骨基質(zhì)增多，而染成藍(lán)色的軟骨基質(zhì)減少。
　　 通過(guò)第一部分

11、和第二部分的結(jié)果初步了解到：（1）抑制p38MAPK信號(hào)通路后能夠降低BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞體外及體內(nèi)的成骨分化；（2）抑制ERK1/2信號(hào)通路后能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞體外及體內(nèi)的成骨分化。因此，在第三部分將從以下兩方面探討其可能的分子機(jī)制：（1）抑制MAPKs信號(hào)通路對(duì)BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化進(jìn)程中的細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞周期的影響及其相互關(guān)系；（2）在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中MAPKs信號(hào)通路對(duì)B

12、MPs經(jīng)典信號(hào)通路的影響。首先，通過(guò)使用p38MAPK和ERK1/2的特異性抑制劑在抑制p38MAPK和ERK1/2活性的情況下，在2-9天連續(xù)監(jiān)測(cè)BMP9誘導(dǎo)的C3H10t1/2細(xì)胞ALP活性的變化，結(jié)果顯示，抑制ERK1/2的活性后ALP的活性在第4天開始增加，并在第5-6天出現(xiàn)了一個(gè)急劇的升高，但是并沒有如之前假設(shè)的抑制。ERK1/2的活性后將BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP活性最高峰出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)提前，而表現(xiàn)為ALP的活性隨著時(shí)

13、間的增加而存在一個(gè)持續(xù)性的增高，這表明抑制ERK1/2的活性后使BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的分化持續(xù)增強(qiáng)。接下來(lái)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞分化進(jìn)程中各組細(xì)胞增殖的改變，結(jié)果顯示，抑制ERK1/2的活性后細(xì)胞在第4天后的增殖明顯增高，提示抑制ERK1/2的活性后其ALP活性的增強(qiáng)有可能是由于其促使細(xì)胞增殖的增加而導(dǎo)致的。隨后，用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞分化進(jìn)程中各組細(xì)胞的細(xì)胞周期的變化情況，結(jié)

14、果顯示：各組細(xì)胞間的不同細(xì)胞周期時(shí)相的變化在第1-3天間以及7-10天間變化沒有明顯區(qū)別，而在4-6天期間各組細(xì)胞間的不同時(shí)相出現(xiàn)了不同程度的差異，并且這種差異主要表現(xiàn)在抑制ERK1/2的活性后促使其S期細(xì)胞比例明顯增多。這提示我們，抑制ERK1/2的活性后其對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用可能與其能增加分化進(jìn)程中S期細(xì)胞的比例并促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)。另外，在第三部分通過(guò)Western Blot的方法檢測(cè)了使用p38MAPK和

15、ERK1/2的特異性抑制劑抑制p38MAPK和ERK1/2活性的情況下，其對(duì)Smadl（ser463/465）/Smad5（ser463/465）/Smad8（ser426/428）C末端的絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化影響進(jìn)行了檢測(cè)，。接下來(lái)，采用激光共聚焦的方法檢測(cè)Smad1/5/8在細(xì)胞內(nèi)定位的改變，結(jié)果顯示，BMP9能明顯增加Smad1/5/8的核內(nèi)轉(zhuǎn)移；但是抑制p38MAPK的活性后Smad1/5/8的核內(nèi)轉(zhuǎn)移相對(duì)BMP9組有所減弱；而抑

16、制ERK1/2的活性后Smad1/5/8的核內(nèi)轉(zhuǎn)移增加，但與BMP9組區(qū)別不大。最后，采用Real time PCR的方法檢測(cè)BMPs/Smad經(jīng)典信號(hào)通路的下游靶基因Smad6和Smad7 mRNA的表達(dá)情況。這提示，抑制p38MAPK的活性后其對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的抑制作用可能與其對(duì)BMPs/Smad信號(hào)通路的下調(diào)相關(guān)。
　　 通過(guò)第三部分結(jié)果，初步得知：（1）抑制ERK1/2的活性后其對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)

17、干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用可能與其能增加分化進(jìn)程中S期細(xì)胞的比例并促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)，其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。（2）抑制p38MAPK的活性能夠減少Smad1/5/8 C末端絲氨酸的磷酸化水平維持的時(shí)間、減弱Smad1/5/8的核內(nèi)轉(zhuǎn)移并下調(diào)BMPs/Smad經(jīng)典信號(hào)通路靶基因的表達(dá)，從而對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化產(chǎn)生影響。
　　 綜上所述，BMP9能夠激活MAPKs信號(hào)通路；抑制p38MAPK信號(hào)通路后能夠降低