奶山羊泌乳期乳腺組織microRNA表達(dá)譜分析及miR-143調(diào)控IGFBP5對細(xì)胞作用研究.pdf

1、奶山羊的泌乳在整個(gè)泌乳期具有規(guī)律性，在泌乳初期泌乳量較低，隨后逐漸升高達(dá)到高峰期并維持一定時(shí)間，隨著泌乳的不斷進(jìn)行，泌乳量將逐漸下降直至干乳期。因此，了解奶山羊乳腺發(fā)育和泌乳規(guī)律，利用分子手段改善奶山羊泌乳遺傳性能，以延長奶山羊的泌乳期或提高泌乳量。目前，對奶山羊泌乳規(guī)律的研究主要采用候選基因法，并發(fā)現(xiàn)了大量與泌乳相關(guān)的候選基因，但其參與泌乳規(guī)律的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。
　　 MicroRNA是一類長度約22 nt的非蛋白編碼的RN

2、A，在動(dòng)物的進(jìn)化過程中高度保守且具有表達(dá)的時(shí)空特異性，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶mRNA的表達(dá)，廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化與凋亡以及器官的發(fā)育等眾多生物學(xué)過程。乳腺的發(fā)育與泌乳是乳腺上皮細(xì)胞不斷增殖、分化與凋亡的同期性過程。有研究表明miRNA在乳腺發(fā)育不同時(shí)期呈現(xiàn)差異表達(dá)模式，是乳腺發(fā)育與泌乳的重要調(diào)控因子。
　　 本研究以5只嶗山奶山羊在不同泌乳時(shí)期的乳腺組織為研究材料，分別構(gòu)建了泌乳初期（產(chǎn)后20天），泌乳高峰期（產(chǎn)后90天）

3、和泌乳末期（產(chǎn)后210天）三個(gè)小RNA文庫，采用Illumina/Solexa高通量測序技術(shù)對構(gòu)建的三個(gè)文庫分別進(jìn)行測序，并對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量檢測和長度分布統(tǒng)計(jì)，基因組定位及小RNA分類注釋，篩選出了在三個(gè)文庫中差異表達(dá)的miRNA。采用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測、基因功能注釋和KEGG通路分析。通過Solexa高通測序分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-143在不同泌乳時(shí)期具有高表達(dá)豐度且呈現(xiàn)差異表達(dá)模式，生物信息學(xué)

4、分析表明:其靶基因參與了乳腺的發(fā)育、細(xì)胞生長等生物學(xué)過程，采用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)和qRT-PCR對miR-143及其潛在靶基因IGFBP5進(jìn)行了靶向調(diào)控關(guān)系研究，采用MTT法、熒光Hoechst/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)研究了miR-143對乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)通過Solexa高通量測序，在泌乳初期、泌乳高峰期和泌乳末期三個(gè)文庫中分別獲得18，031，615、19，044，002和7

5、，385，833純凈序列讀數(shù)，分別占到其高質(zhì)量讀數(shù)的97.88％、98.45％和73.87％。
　　 (2)小RNA長度分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:三個(gè)文庫中小RNA序列主要分布在19-24 nt之間，22 nt序列最多，在三個(gè)文庫中分別占到44.04％、41.48％和33.96％，其次為20 nt和23 nt。不同片段長度的小RNA在三個(gè)文庫中呈現(xiàn)差異分布。
　　 (3)綿羊基因組定位分析結(jié)果表明:在泌乳初期、泌乳高峰期和泌乳末

6、期三個(gè)文庫中分別有44，928種序列（9，093，530條讀數(shù)）、69，244種序列（8，941，279條讀數(shù)）和32，509種序列（3，916，179條讀數(shù)）定位到綿羊基因上，分別占總序列的50.43％、46.95％和53.02％。
　　 (4)三個(gè)文庫中共發(fā)現(xiàn)已知miRNA336個(gè)，189個(gè)呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)，表達(dá)豐度在1，000，000以上的有5個(gè)，let-7a、let-7b、miR-143、miR-378、miR-148a

7、;在100,000-1,000,000的有10個(gè)，miR-30e-5p、miR-30d、miR-30a-5p、miR-21、miR-200c、miR-146b、miR-126、miR-103、let-7f、 let-7c。三個(gè)庫中共同表達(dá)的有289個(gè)，在兩個(gè)文庫中共同表達(dá)的有26個(gè)，僅在一個(gè)文庫中表達(dá)的有21個(gè)，其中僅在泌乳初期表達(dá)7個(gè)，僅在泌乳高峰期表達(dá)8個(gè)，僅在泌乳末期表達(dá)6個(gè)。
　　 (5)差異表達(dá)miRNA生物信息學(xué)分析

8、表明:對189個(gè)差異表達(dá)miRNAs采用TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測，共獲得10，325個(gè)非冗余的靶基因。通過Blast2GO和DAVID分析，有9，341個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫獲得了功能注釋，F(xiàn)DR＜0.05的GO注釋為1，229條，顯著富集的通路有68個(gè)(P＜0.05)。富集到了MAPK signaling pathway、Wnt signalingpathway、Insulin signaling pathway、Jak-STA

9、T signaling pathway等與泌乳有關(guān)的信號(hào)通路。
　　 (6)三個(gè)文庫中共發(fā)現(xiàn)50個(gè)新miRNA，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明:共獲得13，298個(gè)靶基因EST序列，125，846條GO注釋，參與了237條通路。顯著富集到Metabolicpathways、ECM-receptor interaction等與泌乳有關(guān)的通路。
　　 (7) qRT-PCR分析了miR-143及其潛在靶基因IGFBP5在三個(gè)泌乳

10、時(shí)期的表達(dá)特征，結(jié)果表明miR-143與IGFBP5在不同泌乳時(shí)期乳腺組織表達(dá)趨勢相同，均在泌乳高峰期低表達(dá)。通過構(gòu)建miR-143真核表達(dá)載體，野生型和突變型IGFBP5雙熒光素酶報(bào)告基因載體，體外轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮原代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-143靶向IGFBP53'-UTR，并正向調(diào)控其表達(dá)。
　　 (8)MTT法、熒光Hoechst33342/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-143對乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響，結(jié)果表明:mi