金華豬和大約克豬泌乳期乳腺組織的microRNA和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析.pdf

1、母乳的產(chǎn)量和質(zhì)量影響哺乳仔豬的生長(zhǎng)速度、健康和成活率，也影響仔豬斷奶體重或適宜斷奶日齡，從而影響其后期的生長(zhǎng)肥育性能。而泌乳性能主要取決于泌乳期乳腺組織的生長(zhǎng)發(fā)育，例如乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和活力等。為了獲得較好的哺乳仔豬生長(zhǎng)性能，弄清母豬乳房的生物特性是非常重要的。乳腺的發(fā)育歷經(jīng)胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期、以及退化期等一系列時(shí)期，同時(shí)也是雌性哺乳動(dòng)物出生之后唯一能夠多次生長(zhǎng)發(fā)育的器官。乳腺的重量、DNA含量和泌乳量的高峰期大約出現(xiàn)在母

2、豬泌乳期的21天。研究表明許多因子和激素參與了乳腺的發(fā)育和泌乳的過程。MicroRNA（miRNA）在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，miRNA參與調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育及泌乳相關(guān)基因的表達(dá)。盡管關(guān)于哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育和泌乳機(jī)制的研究開展較早，但相對(duì)于人類、小鼠、牛、羊等生物而言，豬的乳腺研究比較缺乏。
　　本研究選擇泌乳期21天金華豬和大約克豬各3頭作為實(shí)驗(yàn)材料，采取乳腺組織，提取總R

3、NA。首先利用Illumina/Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)金華豬和大約克豬乳腺組織進(jìn)行miRNA和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以獲得兩豬種乳腺組織miRNA和基因表達(dá)信息，篩選差異表達(dá)的miRNA和基因，采用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的miRNA和基因進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)、基因功能注釋和KEGG通路分析。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量法(RT-PCR)比較了金華豬和大約克豬乳腺組織上與乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　具體結(jié)果如下:
　　(1

4、)金華豬和大約克豬乳腺組織小RNA測(cè)序分析
　　通過測(cè)序，金華豬和大約克豬乳腺小RNA文庫(kù)中分別得到17，044，789和16，545，454條可比對(duì)的讀數(shù)。去除掉其他類型的已知小片段RNA(rRNA，tRNA，snoRNA和snRNA)、重復(fù)片段以及mRNA的降解片段后分別獲得9，672，024和6，946，954純凈序列即可用于后續(xù)miRNA的序列分析。miRNA長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)乳腺組織miRNA序列長(zhǎng)度主要分布在20～24

5、nt范圍內(nèi)，符合動(dòng)物miRNA的長(zhǎng)度分布特點(diǎn)。物種間進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)豬乳腺組織miRNA在物種間有高度保守性，與人類的同源性最高，其次是牛和小鼠?；蚪M定位分析發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的miRNA在豬基因組染色體上的位置分布差異很大，比對(duì)上18號(hào)、2號(hào)、6號(hào)染色體的miRNA數(shù)量最多，7號(hào)、8號(hào)染色體上的miRNA較少。對(duì)文庫(kù)中的已知的miRNA進(jìn)行顯著性差異分析，共有417個(gè)差異表達(dá)的miRNA(P＜0.05)，對(duì)應(yīng)著228個(gè)pre-miRNA

6、。對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因功能注釋和KEGG通路分析，這些基因主要富集到TGF-β、MAPK、PPAR等信號(hào)通路以及谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成等生物學(xué)過程中。這些通路對(duì)于乳腺發(fā)育以及乳汁成分合成都有重要的作用。
　　(2)金華豬和大約克豬乳腺組織mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
　　利用RNA-seq技術(shù)對(duì)構(gòu)建的兩個(gè)品種乳腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示金華樣品共測(cè)得約2.27Gb的數(shù)據(jù)，大約克樣品中共測(cè)得約2.34G

7、b的數(shù)據(jù)量。將新預(yù)測(cè)的兩個(gè)樣本的基因、轉(zhuǎn)錄本和外顯子的統(tǒng)計(jì)信息與Ensembl既有的豬的參考基因組信息進(jìn)行比較，分別檢測(cè)到21467和29572個(gè)轉(zhuǎn)錄本。其中最多的是在2號(hào)染色體上，其次是1號(hào)染色體，最少的是線粒體染色體。在本研究中，共獲得3032個(gè)差異表達(dá)基因（P＜0.05），差異表達(dá)水平比值的范圍為-20.0722到17.3565，其中上調(diào)表達(dá)的有1755個(gè)基因，下調(diào)有1247個(gè)基因。差異基因的GO和KEGG分析揭示它們涉及的通路包

8、括氨基酸代謝通路、脂肪酸生物合成、胰島素信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、氧化磷酸化、甘油磷脂代謝、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等。(3) RT-PCR結(jié)果顯示，大約克乳腺組織中GHR、IGF-1R、INSR、PRLR等激素受體基因表達(dá)水平都顯著高于金華豬乳腺組織（P＜0.05）。乳蛋白基因CSN2在金華豬乳腺中表達(dá)水平顯著高于大約克豬（P＜0.01），但是LALBA基因在兩者之間差異不顯著(P＞0.05)。與金華豬相比，miR-138在大約克的乳腺中高表達(dá)，

9、且差異極顯著(P＜0.01); miR-26a、miR-186、miR-126、 miR-92a和miR-let-7g在大約克中低表達(dá)，差異極顯著（P＜0.01）。
　　(4)成功分離培養(yǎng)了金華豬乳腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。轉(zhuǎn)染miR-148a mimics和inhibitor之后，RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明了mimics能增加細(xì)胞中miR-148a的表達(dá)(P＜0.01)，inhibitor能降低miR-148a的表