地鱉蟲纖溶活性蛋白的分離純化及抗腫瘤活性研究.pdf

1、本研究以雌性地鱉蟲為原料，經(jīng)過pH7.4、0.01mol/L磷酸鈉緩沖液過夜提取，4000r/min離心20min，去沉淀，上清液用硫酸銨鹽析法提取蛋白質(zhì)，收集40％-65％飽和度蛋白質(zhì)鹽析組分，透析除鹽得到粗蛋白。用自動核酸蛋白分離層析儀分離并收集蛋白質(zhì)組分，洗脫是通過使用含有1.0mol/L氯化鈉的0.02mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，恒流泵流速調(diào)整為0.6ml/min，自動部分收集器調(diào)整為10min收集一

2、管。收集兩組蛋白質(zhì)峰，并且通過真空冷凍干燥法將蛋白質(zhì)凍成粉末，存放于-20℃?zhèn)溆谩?⑴將提取所得的蛋白質(zhì)粉末，用pH7.4的磷酸鈉緩沖液稀釋成特定濃度，利用纖維蛋白平板法分別檢測所收集的兩種蛋白質(zhì)的纖溶活性。經(jīng)過檢測，兩組蛋白質(zhì)均有纖溶活性，同時也具有纖溶激酶活性。因此，兩組蛋白質(zhì)均是纖溶活性蛋白，分別將兩組蛋白質(zhì)命名為地鱉蟲纖溶活性蛋白組分Ⅰ（EFP-Ⅰ）和地鱉蟲纖溶活性蛋白組分Ⅱ（EFP-Ⅱ）。通過SDS-PAGE電泳檢測地

3、鱉蟲純度檢驗，結(jié)果均呈現(xiàn)單一條帶，參照標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白（mark），EFP-Ⅰ和EFP-Ⅱ的分子量分別為31.9 kD和41.3kD，并且兩種蛋白質(zhì)均是單亞基結(jié)構(gòu)，因此，EFP-Ⅰ和EFP-Ⅱ有可能地鱉蟲的同一類纖溶酶。 ⑵對EFP的相關(guān)性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明：EFP的熱穩(wěn)定性較差，40℃溫浴30min其纖溶活力降到0.8U；EFP的纖溶活性受溫度的影響顯著，最適作用溫度約為40℃；EFP的纖溶活性受pH影響較為顯著，其作用的最適

4、pH值為8.0；Na+和K+對EFP的纖溶活力基本無影響，而Mg2+和Ca2+則對其活力有較強的抑制作用；1mg/ml的尿素、巰基乙醇、EDTA和PMSF變性劑對EFP的活性均具有很強的抑制作用。 ⑶采用MTT法檢測EFP在體外對人舌癌細胞Tea-8113增殖的抑制作用，結(jié)果顯示EFP在體外能顯著抑制人舌癌細胞Tea-8113的增殖，并且呈現(xiàn)明顯的藥物劑量和時間依賴關(guān)系。5個EFP濃度（0.0101g/ml，0.0302g/ml

5、，0.0501g/ml，0.0702g/ml和0.0902g/ml）處理組在3個處理時間內(nèi)，舌癌Tea-8113細胞增殖被抑制的情況為：24h后，細胞增殖抑制率分別為8.53％，16.37％，26.96％，53.14％和92.06％；48 h后，細胞增殖抑制率分別為-4.71％，10.91％，33.14％，84.22％和91.90％；72 h后，細胞增殖抑制率分別為6.51％，37.07％，46.92％，69.58％和92.96％。