PP4C在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、功能及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本研究共分為三部分。第一部分，應(yīng)用Western Blot、Real-time PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)PP4C在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并分析PP4C的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。第二部分，檢測(cè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251、U87和正常膠質(zhì)細(xì)胞Astrocyte中PP4C的表達(dá)，并探討沉默PP4C基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87增殖、遷移和侵襲的影響。第三部分，應(yīng)用生物信息軟件預(yù)測(cè)調(diào)控PP4C的潛在miRNA，即

2、miR-128-3p，通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其真實(shí)性:并用Westem Blot及Real-time PCR檢測(cè)miR-128-3p對(duì)PP4C蛋白及mRNA的影響;進(jìn)一步在膠質(zhì)瘤組織中檢測(cè)miR-128-3p的表達(dá)，并分析其與PP4C的相關(guān)性。
　　第一部分 PP4C在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中表達(dá)及其臨床病理特征相關(guān)性研究
　　目的:
　　1.探討PP4C蛋白和mRNA在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和正常腦組織的表達(dá)情況

3、。
　　2.探討PP4C異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.采用Western Blot和Real-time PCR和檢測(cè)PP4C蛋白和mRNA在新鮮膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)。
　　2.采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)120例腦膠質(zhì)瘤組織及10例正常腦組織中PP4C蛋白表達(dá)情況及分析其表達(dá)與膠質(zhì)瘤WHO病理級(jí)別的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.PP4C蛋白和mRNA在

4、腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常腦組織。并且PP4C蛋白和mRNA表達(dá)隨WHO病理級(jí)別增高有逐漸升高的趨勢(shì)，與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。
　　2.PP4C陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核和胞漿染成淺黃色、棕黃色或者黃褐色。PP4C蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織的高表達(dá)率為60％(72/120)，在10例正常腦組織中PP4C均呈低表達(dá)。除此之外，PP4C蛋白在Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的高表達(dá)率分別為21.43％(6/28)、55.56％(20/36)、82.14％(

5、46/56)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。Kaplan-Meier生存分析表明PP4C高表達(dá)的患者預(yù)后比PP4C低表達(dá)的患者預(yù)后差。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素、多因素分析顯示PP4C蛋白高表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)論:
　　PP4C蛋白和mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與正常腦組織相比顯著增高，并與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)相關(guān):預(yù)后分析表明PP4C高表達(dá)是膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　第二部分 P

6、P4C在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及沉默PP4C基因?qū)?xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　目的:
　　1.探討人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251、U87及正常膠質(zhì)細(xì)胞Astrocyte中PP4C的表達(dá)情況。
　　2.探討沉默PP4C基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87增殖、遷移和侵襲的影響。
　　方法:
　　1.采用Western Blot和Real-time PCR和檢測(cè)PP4C蛋白和mRNA在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及正

7、常膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　2.si-RNA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:設(shè)計(jì)合成PP4C-siRNA干擾序列，并實(shí)驗(yàn)將U251和U87細(xì)胞株各分成兩組，即實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染PP4C-siRNA）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA），用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　3.PP4C基因沉默效率的檢測(cè):使用Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)PP4C-siRNA沉默效率。
　　4.采用CCK-8及EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默PP4C基因后

8、U251、U87細(xì)胞的增殖能力變化。
　　5.采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默PP4C基因后U251、U87細(xì)胞遷移能力的變化。
　　6.采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默PP4C基因后U251、U87細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.PP4C在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
　　應(yīng)用Western Blot及Real-time PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251、U87及正常膠質(zhì)細(xì)胞Astrocyte結(jié)果顯示，

9、PP4C蛋白及mRNA在4種細(xì)胞系中均存在表達(dá)，在U251、U87細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量較高，A172細(xì)胞次之，Astrocyte中相對(duì)表達(dá)量最低，因此篩選出U251、U87優(yōu)勢(shì)表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.檢測(cè)PP4C-siRNA的沉默效率
　　使用Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)PP4C-siRNA沉默效率。Real-timePCR及Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，相對(duì)于陰性對(duì)照

10、組，PP4C-siRNA明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87中PP4C mRNA及蛋白的表達(dá)（P均＜0.01）。
　　3.PP4C基因沉默對(duì)U251、U87細(xì)胞系增殖能力的影響
　　CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組(NC)相比，P4C-siRNA實(shí)驗(yàn)組U251、U87細(xì)胞增值率顯著降低，分別降低了54％、50％，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組(NC)相比，PP4C-siRN

11、A實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率顯著降低，U251、U87細(xì)胞分別降低了51％、64％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，PP4C可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖能力，沉默PP4C后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖明顯降低。
　　4.PP4C基因沉默對(duì)U251、U87細(xì)胞系遷移能力的影響
　　劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，PP4C-siRNA組細(xì)胞遷移數(shù)明顯下降，其中U251細(xì)胞減少了56％，U87細(xì)胞減少了66％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

12、P＜0.01)。
　　5.PP4C基因沉默對(duì)U251、U87細(xì)胞系侵襲能力的影響
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組(NC)相比，PP4C-siRNA實(shí)驗(yàn)組穿過小室結(jié)晶紫染色細(xì)胞顯著減少，其中U251細(xì)胞減少了52％，U87細(xì)胞減少了39％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.PP4C在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中高表達(dá)，并篩選出U251、U87優(yōu)勢(shì)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　

13、2.PP4C siRNA可以明顯沉默PP4C的表達(dá)，并可以抑制U251、U87細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。表明PP4C可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　第三部分 miR-128-3p與PP4C基因的靶向調(diào)控關(guān)系研究
　　目的:
　　1.預(yù)測(cè)可能調(diào)控PP4C的潛在miRNA。
　　2.驗(yàn)證miR-128-3p是否轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控PP4C的表達(dá)。
　　3.檢測(cè)miR-128-3p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

14、，并分析miR-128-3p與PP4C表達(dá)相關(guān)性。
　　方法:
　　1.采用靶基因預(yù)測(cè)算法對(duì)調(diào)控PP4C的潛在miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，分析PP4C的3'-UTR區(qū)域存在miR-128-3p的結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在293T細(xì)胞中驗(yàn)證miR-128-3p與PP4C是否存在直接相互作用，進(jìn)一步在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87中驗(yàn)證miR-128-3p與PP4C是否存在直接相互作用。
　　3.

15、miR-128-3p mimics、miR-NC mimics轉(zhuǎn)染U251、U87細(xì)胞，分別利用WesternBlot和Real-time PCR檢測(cè)PP4C的蛋白和mRNA水平。
　　4.Real-time PCR檢測(cè)miR-128-3p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，并分析miR-128-3p與PP4C表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件顯示在PP4C的3'-UTR區(qū)域存在miR-128-3p的結(jié)合位點(diǎn)。<

16、br>　　2.首先在293T細(xì)胞中，miR-128-3p能直接與PP4C3'-UTR上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而抑制熒光素酶表達(dá)。其次，miR-128-3p可以在U251和U87細(xì)胞中可以與PP4C3'-UTR結(jié)合從而抑制熒光素酶活性，從而驗(yàn)證了miR-128-3p與PP4C的直接相互作用，PP4C是miR-128-3p的直接靶基因。
　　3.48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染miR-128-3p過表達(dá)miR-128-3p U251、U87細(xì)胞中PP4C蛋

17、白水平相比與轉(zhuǎn)染NC的U251、U87細(xì)胞是顯著降低的，而膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞中過表達(dá)miR-128-3p后，PP4C mRNA水平?jīng)]有顯著變化。預(yù)示PP4C作為miR-128-3p的直接靶基因，并被其負(fù)調(diào)控。
　　4.miR-128-3p在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平顯著低于正常腦組織。并且發(fā)現(xiàn)miR-128-3p的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高逐漸降低。在膠質(zhì)瘤組織中，miR-128-3p的表達(dá)水平與PP4C蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)