人類巨細胞病毒感染對臍血粒系祖細胞發(fā)育過程中Hoxa9、Hoxa10基因表達的影響.pdf

1、目的：本課題主要探討人類臍血造血干細胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)向粒系(Colony Forming Unit-Granulocyte，CFU-G)發(fā)育過程中Hoxa9、Hoxa10基因表達的情況，用人類巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)和/或全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)進行干預，在基因水平探討HCMV感染導致臍血粒系祖細胞損傷的

2、機制。 方法：1.12例臍血標本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。2.實驗分組。實驗分4組：(1)空白對照組(Normal)：不加病毒液，代之等量DMEM/F12培養(yǎng)基加入基本培養(yǎng)體系。(2)ATRA組：加入ATRA稀釋液，終濃度6×10-8mol/l。(3)HCMV組：HCMV-AD169滴度為106蝕斑形成單位(plaque formation unit，PFU)/ml，按0.1ml 105 PFU/

3、ml接種培養(yǎng)體系。(4)ATRA+HCMV組：同時加入ATRA及HCMV-AD169病毒稀釋液0.1ml，終濃度同上。3.采用造血干細胞體外培養(yǎng)技術，以HCMV-AD169和(或)ATRA持續(xù)干擾人類造血干細胞，觀正常組、ATRA組、HCMV組、ATRA+HCMV組的造血干祖細胞經(jīng)人粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating，G-CSF)誘導后，在培養(yǎng)過程第3天，7天和12天的粒系祖細胞集落(Col

4、onyFormingUnit-Granulocyte，CFU-G)生成情況。4.采用瑞氏染色法鑒定粒系祖細胞集落成分。5.第3天、第7天、第12天分別提取各組細胞總RNA，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。6.通過隨機引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reacti

5、on,FQ-RT-PCR)技術檢測臍血粒系祖細胞增殖分化過程中各組Hoxa9、Hoxa10基因的表達。7.隨機抽取逆轉(zhuǎn)錄的Hoxa9、Hoxa10基因進行電泳分別獲得Hoxa9、Hoxa10基因在3天、7天、12天電泳圖。將Hoxa9、Hoxa10基因cDNA和人磷酸甘油醛脫氫酶(Gluceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因陽性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標準曲線，根據(jù)各個樣本循環(huán)指數(shù)

6、增長期的起始點即循環(huán)域值(cycle threshold，Ct)和標準曲線斜率計算各自樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值，以GAPDH基因作為內(nèi)參照進行標化。8．統(tǒng)計方法：結(jié)果用DNA相對拷貝數(shù)和RNA表達相對量(2-△△α)表示Hoxa9、Hoxa10基因相對表達量，采用均數(shù)加減標準差(-X±S)表示Hoxa9、Hoxa10基因的變化情況。進行方差齊性檢驗，TOW-WAY AONVA方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法，正常組Hoxa9及H

7、oxa10基因相對表達量比較采用配對設計均數(shù)t檢驗。由統(tǒng)計學軟件SPSS10.0完成。 結(jié)果：1．集落細胞的形態(tài)學鑒定，瑞氏染色法證明所培養(yǎng)的細胞是粒細胞。2．1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s，18s，28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結(jié)構完整，無明顯降解。3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增三組均有目的基因Hoxa9、Hoxa10和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴增產(chǎn)物大小分

8、別為：Hoxa9為144bp，Hoxa10為166個堿基(bp)，GAPDH基因為141bp，與預定理論值大小符合。4．在第3天、7天、12天Hoxa9基因相對表達量較Hoxa10高。從電泳圖也可以直觀看出，各時間點Hoxa9基因各電泳條帶均較Hoxa10電泳條帶亮度亮，寬度寬，表明Hoxa9基因表達產(chǎn)物較H0xa10高。5．隨時間推移，正常對照組、 ATRA組、HCMV組、及ATRA+HCMV組，Hoxa9、Hoxa10基因均在增殖分

9、化的第7天表達最強烈，第12天表達明顯減弱。6．與正常對照組比較，Hoxa9、Hoxa10基因受ATRA(6×10-8mol/L)上調(diào)，而受HCMV下調(diào)。7．與HCMV組比較，ATRA有抑制HCMV所致的Hoxa9、Hoxa10基因的下調(diào)作用。 結(jié)論：1．Hoxa9、Hoxa10基因在臍血粒系祖細胞發(fā)育過程中呈現(xiàn)規(guī)律的表達，提示Hoxa9、Hoxa10基因均與粒系造血有相關性。2．人類造血干細胞向粒系祖細胞增殖分化過程中，正常對

10、照組、ATRA組、HCMV組及ATRA+HCMV組的Hoxa9、Hoxa10基因第3天少量表達，第7天表達最強烈，第12天表達明顯下降。3．Hoxa9基因可能是人類造血干祖細胞向粒系祖細胞增殖分化過程的主要基因之一。4．HCMV能使Hoxa9、Hoxa10基因表達下調(diào)，提示HCMV可能通過調(diào)控Hoxa9、Hoxa10基因表達異常引起造血系統(tǒng)的損害。5．ATRA(6×10-8mol/L)能上調(diào)Hoxa9、Hoxa10基因的表達，提示ATR