全反式維甲酸對(duì)臍血粒單系、紅系和淋巴系祖細(xì)胞HOXB6基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 本課題主要探討人臍血造血干細(xì)胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）向粒-單系祖細(xì)胞（Colony Forming Unit-Granulocyte-Monocyte，CFU-GM）、紅系祖細(xì)胞（Colony Forming Unit-Erythroid，CFU-E；Brust Forming Unit-Erythroid, BFU-E）和淋巴系祖細(xì)胞（Colony Forming Unit-T-L

2、ymphocyt，CFU-TL）增殖過程中HOXB6基因表達(dá)的情況，并用全反式維甲酸（all-trans retinotic acid，ATRA）進(jìn)行干擾，以觀察在此過程中ATRA對(duì)HOXB6基因表達(dá)的影響,以初步探討ATRA能有效治療粒系白血病,特別是急性早幼粒細(xì)胞白血病的可能機(jī)制。 方法： 1．所有臍血標(biāo)本均由本院產(chǎn)科提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。 2. 實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分為兩組： （

3、1）空白對(duì)照組：不加ATRA,代之以等量的IMDM培養(yǎng)液； （2）ATRA組：加入ATRA稀釋液0.1ml處理,終濃度為60nmol/L。 3.采用造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以ATRA持續(xù)干擾人類造血干細(xì)胞，觀察空白對(duì)照組和ATRA組的人臍血HSC經(jīng)人粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-Monocyte-Colony stimulating factor,GM-CSF）、促紅細(xì)胞生成素（Erythropo

4、ietin, EPO）和植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）分別誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)過程第3天，7天和12天CFU-GM、CFU-E與CFU-TL集落生成情況。 4.分別采用瑞-姬染色法鑒定粒-單系祖細(xì)胞和淋巴系祖細(xì)胞，原位聯(lián)苯胺染色法鑒定紅系祖細(xì)胞。 5.不同時(shí)間點(diǎn)即第3天、第7天和第12天分別提取各組細(xì)胞總RNA，用1℅甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。 6.利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

5、反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）技術(shù)和隨機(jī)引物將提取到的各時(shí)間點(diǎn)、不同分組細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)基因特異引物通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Fluorogenic Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, FQ-RT-PCR）儀進(jìn)行體外擴(kuò)增。將HOXB6基因cDNA和

6、人磷酸甘油脫氫酶（gluceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）基因陽(yáng)性產(chǎn)物cDNA梯度稀釋制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各個(gè)樣本循環(huán)指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)域值（cycle threshold, Ct）和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率值計(jì)算各樣本起始cDNA模板量倍數(shù)值，以GAPDH基因作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化，統(tǒng)計(jì)并分析各組樣本HOXB6基因表達(dá)的mRNA的量的情況。 7.隨機(jī)抽取3例逆轉(zhuǎn)錄的HOXB6基因進(jìn)

7、行電泳，獲得HOXB6基因的電泳圖。 8.統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用DNA相對(duì)拷貝數(shù)和RNA表達(dá)相對(duì)量（2-△△Ct）表示HOXB6基因相對(duì)表達(dá)量，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（± S ）表示HOXB6基因的變化情況。進(jìn)行單因素方差分析，由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS14.0完成。 結(jié)果： 1.人類造血干細(xì)胞向粒單系、紅系和淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過程中，各組細(xì)胞HOXB6基因均表達(dá)。 2. 隨著時(shí)間的推移，CFU-GM HOXB6-mRN

8、A在增殖分化的第3天開始表達(dá)，第7天表達(dá)最強(qiáng)烈，第12天表達(dá)明顯減弱；CFU-E HOXB6-mRNA表達(dá)在第3天、第7天和第12天均持續(xù)表達(dá)；而在CFU-TL中，HOXB6-mRNA表達(dá)在第7天最強(qiáng)烈，第12天表達(dá)減弱。 3.與正常對(duì)照組相比較，ATRA可上調(diào)各組HOXB6基因的表達(dá)。 4.提取的總RNA經(jīng)1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示各組RNA電泳圖的三條帶型整齊，無明顯降饑餓帶，表明提取的總RNA純度較高。

9、 5.1.5％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見HOXB6基因DNA擴(kuò)增條帶清晰，沒有雜帶，說明引物設(shè)計(jì)合成無誤。 6.FQ-RT-PCR方法定量目的基因具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。 結(jié)論： 1.在人臍血CFU-GM、CFU-E和CFU-TL的不同增殖階段，HOXB6基因呈現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，提示HOXB6基因與人類造血干細(xì)胞增殖分化過程密切相關(guān)。 2.HOXB6基因在人類造血干細(xì)胞向粒單系、紅系和淋巴系祖細(xì)胞的正常增