人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染對(duì)臍血粒單系祖細(xì)胞增殖過(guò)程中HOXA5，HOXB6基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本課題主要探討人類(lèi)造血干祖細(xì)胞(HematopoieticStem-ProgenitorCell，HSPC)向粒單系(ColonyFormingUnit-Granulocyte-macrophage，CFU-GM)增殖過(guò)程中HOXB6，HOXA5基因表達(dá)的情況，并且用人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)和/或全反式維甲酸(all-trans-retinoticacid，ATRA)進(jìn)行干擾，以探討HC

2、MV、ATRA在此過(guò)程中對(duì)HOXB6、HOXA5基因的影響，以進(jìn)一步明確HCMV抑制臍血粒單系祖細(xì)胞增殖的機(jī)制，以及ATRA能有效治療粒系白血病，尤其是急性早幼粒細(xì)胞白血病的可能機(jī)制。 方法：1.臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤(pán)段臍血。 2.實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分4組：(1)空白對(duì)照組：不加病毒液，代之等量IMDM加入基本培養(yǎng)體系。(2)HCMV組：HCMV-AD169滴度為組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(tis

3、suecultureinfectious，TCID50)10-4.5/0.1ml，按100TCID500.1ml感染培養(yǎng)體系。(3)ATRA組：加入ATRA稀釋液0.1ml，終濃度60nmol/()l。(4)HCMV+ATRA組：同時(shí)加入HCMV-AD169病毒稀釋液0.1ml及ATRA0.1ml，終濃度同上。 3.采用造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以HCMV-AD169和/或ATRA持續(xù)干擾人類(lèi)造血干祖細(xì)胞，觀察正常組、HCMV-A

4、D169組、ATRA組、以及ATRA+HCMV組的人類(lèi)造血干祖細(xì)胞經(jīng)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating，GM-CSF)誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)過(guò)程第3天，7天和12天的粒單系祖細(xì)胞集落(ColonyFormingUnit-Granulocyte-macrophage,CFU-GM)生成情況。 4.采用瑞-姬染色法鑒定粒單系祖細(xì)胞。 5.分別抽提各時(shí)間點(diǎn)，各

5、不同分組細(xì)胞總RNA。 6.將抽提到的各時(shí)間點(diǎn)，不同分組細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction，RQ-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖分化過(guò)程中HOXB6、HOXA5基因的表達(dá)情況。 7.隨機(jī)抽取6例逆轉(zhuǎn)錄的HOXB6、HOXA5基因進(jìn)行電泳，獲得HOXB6、HOXA5電泳圖。 8.統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用DNA相對(duì)拷貝數(shù)和R

6、NA表達(dá)相對(duì)量(2-△△Ct)表示HOXB6、HOXA5基因相對(duì)表達(dá)量，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差((-X)±S)表示HOXB6、HOXA5基因的變化情況。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，ONE-WAY方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0完成。 結(jié)果：(1)人類(lèi)造血干祖細(xì)胞向粒單系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中，正常對(duì)照組、HCMV組、ATRA組、及HCMV+ATRA組的HOXA5基因均不規(guī)律表達(dá)，且表達(dá)多為陰性。(2)HOXB6

7、基因在各組均表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)烈。(3)隨時(shí)間推移，正常對(duì)照組、HCMV組、ATRA組、及HCMV+ATRA組，HOXB6基因均在增殖分化的第7天表達(dá)最強(qiáng)烈，第12天表達(dá)明顯減弱。(4)與正常對(duì)照組比較，HOXB6基因受ATRA(60nmol/()l)的上調(diào)。(5)與正常對(duì)照組比較，HOXB6基因受HCMV下調(diào)。(6)與HCMV組比較，ATRA能抑制HCMV所致的HOXB6基因下調(diào)。(7)提取的總RNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖，可見(jiàn)28

8、S、18S、5S三條帶，無(wú)DNA污染條帶，無(wú)明顯降解條帶，表明提取的總RNA純度較高。(8)1.5％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)HOXB6、HOXA5基因DNA擴(kuò)增條帶清晰，沒(méi)有雜帶，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)合成無(wú)誤。(9)RQ-PCR方法定量目的基因具有特異性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。 結(jié)論：1.HOXA5基因可能不是人類(lèi)造血干祖細(xì)胞向粒單系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程的主控基因。 2.HOXB6基因是人類(lèi)造血干祖細(xì)胞向粒單系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程的主控基因

9、之一。 3.HOXB6基因在人類(lèi)造血干祖細(xì)胞向粒單系細(xì)胞的正常增殖分化過(guò)程中呈現(xiàn)時(shí)間上的規(guī)律性。 4.HCMV能下調(diào)HOXB6基因的表達(dá)，同時(shí)經(jīng)HCMV干擾的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，集落生成較正常組差。HCMV可能通過(guò)調(diào)控HOXB6基因表達(dá)異常引起造血干祖細(xì)胞增殖分化異常。 5.低濃度(60nmol/()l)ATRA能顯著上調(diào)HOXB6基因的表達(dá)，提示ATRA治療白血病的機(jī)制可能與其調(diào)控同源盒基因有關(guān)。