HERG錯義突變A422T和H562P導致LQT綜合征的細胞分子機制.pdf

1、HERG鉀通道電流是心肌細胞動作電位的重要組分,在3期復極化晚期發(fā)揮關(guān)鍵作用。藥物的阻斷作用或HERG基因突變造成該電流減少,可分別導致獲得性LQTS和遺傳性LQTS(LQT2)。就LQT2而言,目前已發(fā)現(xiàn)的突變位點有200多個,但致病機制各不相同。
　　 A422T和H562P是從兩個不同家庭LQTS病人篩選到的錯義突變位點,電生理分析結(jié)果顯示,這兩種不同位點突變通道電流明顯減小,功能缺失,但具體的發(fā)生機制是何,尚不清楚。本課

2、題利用膜片鉗技術(shù)結(jié)合細胞分子生物學技術(shù),研究分析A422T和H562P突變導致HERG鉀通道功能缺失的機制,并探討不同方法的挽救效果,為理解通道蛋白運輸缺陷導致HERG鉀通道功能缺失、造成LQT2的細胞分子機制提供詳實的實驗依據(jù),同時為LQTS疾病的臨床治療提供新視點。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.首先,利用全細胞膜片鉗技術(shù),對分別表達A422T和H562P突變通道的HEK293細胞進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種錯義突變均可

3、導致HERG鉀通道電流幅度減少,電壓依賴性消失,說明A422T和H562P存在不同程度的功能缺失。Western blot實驗結(jié)果顯示,A422T和H562P通道的155 kDa成熟蛋白組分消失,提示突變蛋白存在轉(zhuǎn)運障礙。這一結(jié)果進一步在免疫細胞化學檢測實驗得到證實,表現(xiàn)在A422T與H562P突變通道蛋白膜分布減少,胞質(zhì)內(nèi)蛋白增加,且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位,說明兩種突變通道蛋白由于轉(zhuǎn)運障礙而被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。
　　 2.其次,將WT與

4、A422T或H562P的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293細胞,利用全細胞膜片鉗技術(shù)及western blot檢測的結(jié)果顯示,雜合型通道的電流及成熟蛋白表達均顯著少于WT,并且隨著轉(zhuǎn)染突變體質(zhì)粒量的增加,通道功能和蛋白表達受損加重,說明A422T、H562P對WT的電流及蛋白表達有濃度依賴的負顯性抑制作用。進一步對A422T／WT’(轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒的量為1:1,模擬病人常見雜合基因型)、H562P／WT(轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒的量為1:1,模擬病人常見雜合基因型)的

5、電生理特性進行檢測分析,其結(jié)果表明,除成熟蛋白表達減少外,雜合型通道的動力學與WT相比也有改變,A422T／WT主要表現(xiàn)在激活過程減慢,而H562P／WT表現(xiàn)在失活過程加快。而與A422T／WT相比,H562P／W工具有更快激活,更快失活的特點,這將使通道得開放時間縮短,進而顯著影響動作電位復極化的鉀離子流。這種動力學的改變是導致雜合型通道功能缺陷的另一原因。
　　 3.進一步利用不同方法對A422T、H562P突變通道進行處理

6、,比較其對電流及蛋白表達的挽救作用,分析兩突變體的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運障礙的分子機制。在低溫或E4031處理條件下,A422T突變通道的功能和蛋白轉(zhuǎn)運均可得到顯著改善,不但再次證明A422T突變通道蛋白轉(zhuǎn)運障礙發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并且說明該突變通道蛋白可形成基本的四聚體結(jié)構(gòu)及孔道結(jié)構(gòu),系一種錯誤折疊不嚴重的突變蛋白；相反,兩種處理對H562P突變通道卻無效,說明其蛋白折疊錯誤嚴重,無法被常用方法挽救。
　　 在過表達Hsp70和／或Hsp90的

7、情況下,Co-IP檢測證實A422T或H562P與Hsp70和Hsp90三者之間存在相互作用,并且與野生型HERG鉀通道蛋白相比,突變通道蛋白與Hsp70或Hsp90的結(jié)合量也不同；過表達Hsp70和Hsp90對A422T突變通道電流有部分挽救作用,而對蛋白表達沒有顯著影響；這種挽救作用存在于單獨過表達Hsp90而不是Hsp70的條件下,雷公藤紅素-Hsp90的抑制劑可取消其挽救作用。這些說明Hsp70、Hsp90均參與HERG鉀通道蛋

8、白的轉(zhuǎn)運過程,但Hsp90對A422T的蛋白轉(zhuǎn)運更為重要。對H562P突變通道而言,盡管與Hsp70和Hsp90存在相互作用,但無論過表達Hsp70和／或Hsp90,對其功能和蛋白表達都無明顯影響,進一步說明兩種不同位置的錯義突變,影響其功能的機制存在差異。H562P突變無法被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)糾正。
　　 在適度低氧刺激(2％O2作用24 hr)下,對WT通道電流及蛋白成熟過程均有明顯促進作用,也可使A422T突變通道功能部分

9、恢復,但對H562P無影響。提示適當?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)可以促進HERG鉀通道蛋白的轉(zhuǎn)運、成熟。
　　 4.最后,利用反轉(zhuǎn)錄PCR實驗技術(shù)檢測XBP1的剪切情況,了解兩突變體是否在細胞內(nèi)過度堆積,引起ER stress。實驗結(jié)果表明A422T和H562P突變通道蛋白雖然阻滯于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,但并未過多堆積,也未造成ER stress,而是及時進入泛素-蛋白酶體途徑進行降解。
　　 結(jié)論:
　　 1.HER