ARHI通過β-catenin途徑調(diào)控腎癌細(xì)胞的增殖和凋亡.pdf

1、ARHI是一種抑癌基因，該基因在卵巢，乳腺等組織中有高表達(dá)，在很多正常組織中如心、腦、肝等器官中也有表達(dá)。但與之相反的是，在腫瘤細(xì)胞中ARHI的表達(dá)卻很低，如在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等。這種改變可能與DNA甲基化、雜合丟失和組蛋白異常乙?；嘘P(guān)。但是ARHI在腎癌中的表達(dá)、作用和機(jī)制目前尚不明確。本次研究，我們通過細(xì)胞生物學(xué)和分子病理學(xué)方法探討ARHI基因?qū)δI癌增殖及凋亡的作用。
　　目的:檢測腎臟腫瘤細(xì)胞和正常腎組織中ARHI的表

2、達(dá)，了解ARHI的表達(dá)與腎癌的臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。檢測ARHI在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并建立ARHI再表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。分析ARHI對腎癌細(xì)胞的增殖、凋亡的作用以及對細(xì)胞周期的影響。通過對相關(guān)信號通路的研究，探討ARHI在腎癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。
　　材料和方法:我們選取了52例腎癌的臨床標(biāo)本，患者來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科2009年1月至2013年12月就診的腎透明細(xì)胞癌病例。手術(shù)切除患腎及腫瘤，留取腫瘤組織和

3、癌旁正常腎組織標(biāo)本進(jìn)行研究。所有患者術(shù)后證實(shí)病理為腎透明細(xì)胞癌。通過RT-PCR和免疫印跡的方法檢測腫瘤細(xì)胞和對應(yīng)癌旁正常組織細(xì)胞的ARHI蛋白和mRNA的表達(dá)情況。搜集患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級和TNM分期等資料，分析ARHI的表達(dá)與腎癌預(yù)后之間的關(guān)系。并根據(jù)患者的隨訪信息，繪制生存曲線圖。通過免疫組化的方法確定ARHI在腎癌中的表達(dá)位置。培養(yǎng)腎癌ACHN，OS-RC-2，786-O，769-P細(xì)胞系，利用RT-PCR和免疫

4、印跡的方法檢測ARHI在腎癌各細(xì)胞系中的表達(dá)情況。選取ARHI表達(dá)量較低的細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)。通過pcDNA3.1-ARHI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法建立ARHI過表達(dá)的腎癌細(xì)胞系。將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組，載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。通過MTT法檢測ARHI對腎癌細(xì)胞增殖率的影響。利用PI染色法檢測ARHI的表達(dá)對腎癌細(xì)胞周期的影響。通過PI/AnnexinⅤ雙染法，檢測各組細(xì)胞凋亡率的變化，從而說明ARHI對腎癌細(xì)胞凋亡的作用。最后，我們提取各組細(xì)胞

5、的核蛋白和胞漿蛋白，通過免疫印跡的方法檢測Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)蛋白表達(dá)，包括LRP6，P-LRP6，Axin2，GSK-3β，以及胞核和胞漿內(nèi)的β-catenin，從而對ARHI的可能作用機(jī)制進(jìn)行分析和探討。
　　結(jié)果:我們對52例腎癌臨床標(biāo)本進(jìn)行了免疫印跡和RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中ARHI的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常腎組織。二者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ARHI在腎臟細(xì)胞的表達(dá)

6、主要在胞漿中。將52例病人分為ARHI陽性組和ARHI陰性組，發(fā)現(xiàn)ARHI陽性組中位生存時(shí)間明顯高于ARHI陰性組。ARHI的表達(dá)與患者的年齡，性別，腫瘤大小，病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與腫瘤的T分期和M分期有關(guān)。在各腎臟腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)RHI的表達(dá)量均較低，且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。我們選取亞裔來源的細(xì)胞系OS-RC-2進(jìn)行下階段實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)染后ARHI在OS-RC-2中的表達(dá)明顯升高，mRNA的表達(dá)量是未轉(zhuǎn)染組的8.05倍(P＜

7、0.05)，而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。通過MTT法檢測，pcDNA3.1-ARHI轉(zhuǎn)染的OS-RC-2細(xì)胞的增值率得到明顯的抑制，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增值率為未轉(zhuǎn)染組的0.46倍(P＜0.05)，未轉(zhuǎn)染組與空載轉(zhuǎn)染組和無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各組OS-RC-2細(xì)胞通過AnnexinⅤ/PI雙染后，流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的凋亡情況檢測。轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，是未轉(zhuǎn)染組的7.67倍(P＜0.05)。而未轉(zhuǎn)染組與空載體

8、轉(zhuǎn)染組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。通過PI染色后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)染組中63.5％的細(xì)胞停留在G1期，未轉(zhuǎn)染組與空載轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞比例為34.1％和32.8％。與之對應(yīng)的，轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞比例僅為6.3％，而未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞比例分別為32.5％和36.4％。最后我們通過免疫印跡的方法對ARHI的作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ARHI過表達(dá)后，OS-RC-2細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)的β-catenin的表達(dá)受到抑制，未轉(zhuǎn)染組和空

9、載體轉(zhuǎn)染組則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了說明ARHI的作用機(jī)制，我們還檢測了與β-catenin信號通路相關(guān)的蛋白LRP6。轉(zhuǎn)染組LRP6及磷酸化LRP6的蛋白表達(dá)同樣得到抑制，而Axin2和GSK-3β的表達(dá)增加，上述結(jié)果與未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:在腎癌組織中，ARHI的表達(dá)比癌旁正常組織顯著下降，而且ARHI的表達(dá)情況與疾病的預(yù)后相關(guān)。在腎癌細(xì)胞中，ARHI的再表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞的有絲分