HF443-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在赤潮毒素檢測中的初步應(yīng)用.pdf

1、暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文HF443-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在赤潮毒素檢測中的初步應(yīng)用姓名：車軍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：動物學(xué)指導(dǎo)教師：劉潔生20020101暨南人學(xué)頌t “E q k 論文H F 4 4 3 一G F P 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在赤潮毒素檢測中的初步應(yīng)川H F 4 4 3 ．G F P 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在赤潮毒素檢測中的初步應(yīng)用摘要目的：以c ．f o s 啟動子為啟動子、以綠色熒光蛋白為報告基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒H F 4 4 3

2、．G F P ：利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人膀胱移行細胞癌細胞系B I U 一8 7 細胞。培養(yǎng)體系中依次加入赤潮毒素和烏頭堿，觀察烏頭堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的綠色熒光蛋白表達的變化情況，通過熒光量的變化定量赤潮毒素，建立一種以細胞為基礎(chǔ)的赤潮毒素檢測方法。方法：P C R 擴增G F P 基因并用H i n d I I I 和X b a I 雙酶切，與同樣經(jīng)過H i n dI I I 和X b aI 雙酶切并純化的H F 4 4 3 質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒

3、H F 4 4 3 ．G F P 。酶切鑒定重組H F 4 4 3 ．G F P 質(zhì)粒并測序，對比序列和文獻報道是否一致。利用脂質(zhì)體L i p o f e c t A M I N E 2 0 0 0 將重組質(zhì)粒H F 4 4 3 一G F P 轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的B I U 一8 7 細胞，加入N a + 通道激活劑烏頭堿誘導(dǎo)綠色熒光蛋白大量表達，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況，檢測烏頭堿能否誘導(dǎo)B I U ．8 7 細胞中綠色熒光蛋

4、白表達。在赤潮毒素檢測時，細胞培養(yǎng)體系中先后加入不同濃度的赤潮毒素G T X( O ．0 0 3 3 1 a m o l ／L 、0 ．0 3 3 1 ．t m o l ／L 、O ．3 3 l _ t m o l ／L ) 和烏頭堿( 0 ．0 3 3 1 ．t m o l ／L ) ，觀察不同毒素水平下綠色熒光蛋白的表達情況，確定毒素和細胞中綠色熒光蛋白表達的相關(guān)性。結(jié)論：成功構(gòu)建了一個重組質(zhì)粒H F 4 4 3 ．G F P ：重

5、組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B I U ．8 7 細胞后加入烏頭堿，熒光顯微鏡下觀察到細胞發(fā)出綠色熒光并能穩(wěn)定存在3 - 4 天，提示烏頭堿可以誘導(dǎo)B I U - 8 7 細胞中綠色熒光蛋白的表達。在赤潮毒素檢測實驗中，細胞發(fā)出的熒光強度隨毒素水平的增加而減弱，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，提示用這種方法定量檢測赤潮毒素是可行的。關(guān)鍵詞：重組質(zhì)粒H F 4 4 3 ．G F P ，綠色熒光蛋白，人膀胱移行細胞癌細胞系B I U ．8 7 細胞，赤潮毒素檢測，G