雞降鈣素基因重組質粒的構建及其在蛋雞體內的表達研究.pdf

1、降鈣素是動物體內鈣磷調節(jié)的主要激素之一.降鈣素的主要生理作用是抑制破骨細胞來調節(jié)人和動物體內鈣的代謝.因此被廣泛的應用于治療各骨病例如Paget氏病和各種原因引起的高血鈣癥以及原發(fā)性骨質疏松癥.但是由于現在臨床上用的降鈣素大都是鮭魚或者豬的組織提取出來的,所以一般價格昂貴.盡管現在利用基因工程技術將降鈣素基因在原核細胞中進行表達,但在實際應用中還具有非常大的局限性.因此,該研究擬利用分子生物學技術構建雞降鈣素基因的真核表達質粒,在雞體內

2、進行表達并以此來對禽體內鈣的營養(yǎng)調控機制進行研究,并進一步尋找利用基因注射來解決生產中由于的鈣的營養(yǎng)不足而引起的各種缺乏癥的可行性.該研究就是通過已知的雞降鈣素基因序列設計引物,用逆轉錄多聚酶鏈反應擴增出雞降鈣素cDNA,將其插入真核表達載體pCEP4和pcDNA3中構建雞降鈣素基因的真核表達質粒,經酶切和PCR鑒定,確定得到了cCT的真核表達重組質粒pCEP4-CT和pcDNA3-CT.將獲得的兩種真核表達質粒純化后對蛋雞進行腿部肌肉

3、注射,兩周后進行重復一次,并每兩周都取血液樣品,對血液中的降鈣素、甲狀旁腺素、雌二醇及其血鈣血磷進行測定分析,根據體內降鈣素以及其他相關的激素和生理指標的變化來檢驗兩個重組的真核表達質粒在蛋雞體內的表達情況.通過該次實驗得到的結果顯示:1、擴增出來的cDNA,通過序列測定結果表明和國外已經發(fā)表的雞的降鈣素cDNA序列僅有一個核苷酸的差別,中間沒有缺失和插入的現象.證明所得到的是雞的降鈣素cDNA.2、所獲得的雞降鈣素cDNA分別連入真核

4、表達載體pCEP4和pcDNA3中,對篩選出的質粒進行酶切和PCR鑒定,證明得到了重組的雞降鈣素基因真核表達質粒.3、蛋雞體內表達實驗結果表明注射所構建的兩種重組雞降鈣素質粒后,和對照組相比血液中的降鈣素顯著的上升(p<0.05),血鈣有明顯的下降而甲狀旁腺素、雌二醇以及血磷則都有明顯的增高趨勢.結果表明所構建的質粒在蛋雞體內的作用效果明顯.4、同時在實驗中證明,所構建的兩個真核表達質粒pCEP4-cCT和pcDNA3-cCT相比較,前