白細(xì)胞減少性鮑曼不動桿菌肺炎大鼠模型的構(gòu)建及相關(guān)研究.pdf

1、由細(xì)菌引起的感染性疾病是嚴(yán)重威脅人類健康一項(xiàng)重要疾病,自從抗生素的應(yīng)用,該疾病大為改善。然而隨著抗生素廣泛使用,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加,在醫(yī)療條件缺乏的地區(qū)感染性疾病更容易發(fā)生,下呼吸道感染的發(fā)生率和死亡率甚高。據(jù)美國研究,由于肺部感染的緣故,美國近50年來的死亡率沒有下降,甚至還稍微上升。未來有關(guān)公共衛(wèi)生醫(yī)學(xué)對導(dǎo)致感染性疾病如此常見和嚴(yán)重的原因提出了對其潛在的生物學(xué)知識進(jìn)行更深入的研究。動物感染及體外研究是研究肺部感染機(jī)制的的重要手段,是

2、研究人類肺部感染機(jī)制的前提.而動物感染模型被認(rèn)為是研究人類疾病的發(fā)生、發(fā)展及藥物治療療效評價的基本工具。動物模型被廣泛應(yīng)用于研究藥物藥效學(xué)方面起到了不容置疑的地位。目前造成動物肺部感染的途徑主要有:1).直接暴露感染:病原體傳播通過易感染動物的呼出氣體或身體接觸方式,使未感染動物達(dá)到接種感染目的；2.)密封霧化,通過暴露接種動物鼻子或是全身處在一個密閉霧化發(fā)生器,吸入適量的霧化的微生物微粒造成氣管支氣管感染；3).經(jīng)支氣管氣管或口插管接

3、種進(jìn)入下呼吸道:本方式通過氣管滴注或口插管法把接種物直接送進(jìn)動物下呼吸道.4)經(jīng)鼻滴注法:接種物容量范圍5-50ul,太少容量會造成懸浮液過多沉積在上呼吸道影響到達(dá)目的地。
　　 近年來,控制由多重耐藥革蘭陰性菌引起的院內(nèi)感染一直是各國醫(yī)學(xué)界所面臨的重要問題。盡管大量新的抗生素不斷問世和廣泛使用,有效地減少了腸桿菌科院內(nèi)感染的發(fā)生,但非發(fā)酵菌在臨床上分離的致病菌中卻呈增長趨勢,其中最重要的菌種是不懂桿菌和銅綠假單胞菌,不動桿菌中

4、又以鮑曼不動桿菌最為常見。鮑曼不動桿菌是革蘭陰性條件致病菌,廣泛分布于醫(yī)院環(huán)境、水、土壤中,在非發(fā)酵菌中僅次于銅綠假單胞菌而位居第二,已經(jīng)成為院內(nèi)感染重要的病原菌。
　　 現(xiàn)在根據(jù)DNA雜交技術(shù)將不動桿菌分至少可以分為32個基因種,其中7個已命名:①鮑曼不動桿菌(A.banmannii,基因種2):②醋酸鈣不動桿菌(A.calcoacelicus,基因種1);③溶血性不動桿菌(A.haemolyticus,基因種4)；④約翰遜不

5、動桿菌(Ajohnonii,基因種7);⑤洛菲不動桿菌(A.lwoffii,基因種4):⑥瓊氏不動桿菌(A.junii,基因種5):⑦耐放射性不動桿菌(A.radioresistens,基因種12)。根據(jù)表型把不動桿菌鑒定到種的水平比較困難,特別是鮑曼不動桿菌、未命名的基因種3、13TU表型十分接近,所以把它們統(tǒng)稱為鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌。在臨床樣本中分離到的不動桿菌絕大數(shù)為鮑曼不動桿菌,其他菌株較少見。
　　 近幾年來,多重耐

6、藥或泛耐藥的鮑曼不動桿菌已經(jīng)在全球各地出現(xiàn)播散或暴發(fā)流行,并且耐藥率也不斷上升。世界各地相繼報(bào)道了多重耐藥或泛耐藥的鮑曼不動桿菌的暴發(fā)流行。歐洲、北美、中國大陸、中國臺灣等。目前鮑曼不動桿菌的耐藥機(jī)制主要有四種:1)、產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶(包括各種β-內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷修飾酶等):2)細(xì)菌細(xì)胞外膜和青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的改變:3)細(xì)菌細(xì)胞膜通道蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變:4)藥物外排泵,減少抗菌藥物在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的濃度。
　　 針對

7、鮑曼不動桿菌目前臨床上治療面臨著諸多困惑,而且目前缺少相關(guān)穩(wěn)定的鮑曼不動桿菌肺炎動物模型,特別是多重耐藥鮑曼不動桿菌所致的肺炎動物模型尚未見報(bào)道,而且臨床上體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床用藥不完全一致,甚至矛盾?；诖?本研究首先采用環(huán)磷酰胺和糖皮質(zhì)激素制備白細(xì)胞減少的免疫抑制大鼠模型,在此基礎(chǔ)上,采用氣管內(nèi)滴注鮑曼不動桿菌成功建立免疫抑制鮑曼不動桿菌肺炎大鼠模型,為臨床治療鮑曼不動桿菌提供基礎(chǔ)工具。所涉及的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理采用SPSS13.0

8、軟件及部分使用origin軟件。
　　 課題第一部分:環(huán)磷酰胺對大鼠免疫抑制的動物模型建立
　　 背景
　　 近年來隨著腫瘤發(fā)病率的升高與治療進(jìn)步、自身免疫性及其他免疫相關(guān)性疾病的診斷和治療水平提高、器官移植突破與發(fā)展等,白細(xì)胞減少的免疫受損宿主在臨床上也面臨越來越多由于感染治療而造成的困境.而動物感染模型被認(rèn)為是研究人類疾病的發(fā)生、發(fā)展及藥物治療療效評價的基本工具。免疫抑制的動物模型被廣泛應(yīng)用于研究藥物藥效學(xué)方

9、面起到了不容置疑的地位。隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展,臨床上也面臨越來越多免疫低下患者由于感染治療的困境.目前國內(nèi)外研究動物多是應(yīng)用小鼠,鮮見使用大鼠。本研究旨在為臨床研究提供一個基礎(chǔ)。
　　 目的
　　 為了模擬臨床上免疫低下患者,探討環(huán)磷酰胺聯(lián)合地塞米松聯(lián)合應(yīng)用對Sprague Dawleg大鼠免疫功能影響。探索不同劑量給予環(huán)磷酰胺聯(lián)合地塞米松對大鼠免疫抑制影響,尋找最佳濃度。
　　 方法
　　 50只健康清潔級

10、雌性Sprague Dawleg大鼠,隨機(jī)分成五組,間隔性采用腹腔內(nèi)注射方式給予Spmgue Dawleg大鼠注射不同劑量的環(huán)磷酰胺和肌肉內(nèi)注射地塞米松(分別為A組每次環(huán)磷酰胺30mg/kg,地塞米松60mg/kg,共兩次,下同。B組環(huán)磷酰胺45mg/kg,地塞米松90mg/kg,C組環(huán)磷酰胺60mg/kg,地塞米松120mg/kg,D組環(huán)磷酰胺75mg/kg,地塞米松150mg/kg),觀察不同時間段的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、體重變化、活動

11、度、死亡率等指標(biāo)變化。
　　 結(jié)果
　　 各劑量組白細(xì)胞隨時間均有變化減少,均在用藥后第四五天后細(xì)胞數(shù)最少,白細(xì)胞數(shù)量維持在較低水平,過后白細(xì)胞逐步恢復(fù),體重呈遞減趨勢。外周白細(xì)胞:與正常對照組相比,各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),具體為:外周血白細(xì)胞數(shù)雖下降,但免疫效果較輕,恢復(fù)較快,持續(xù)時間短,而C、D組外周血白細(xì)胞數(shù)下降較快,但死亡率較大,B組外周血白細(xì)胞數(shù)下降及死亡率均好,正常對照組在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、活動度方面前后

12、沒明顯變化。
　　 結(jié)論
　　 環(huán)磷酰胺聯(lián)合地塞米松聯(lián)合作用下,在B組(環(huán)磷酰胺90mg/kg地塞米松180mg/kg)劑量下,大鼠死亡率最少,外周血白細(xì)胞減少可以持續(xù)一周左右,免疫效果最佳,適合在此劑量下建立免疫抑制模型。
　　 課題第二部分白細(xì)胞減少性鮑曼不動桿菌肺炎模型
　　 目的
　　 在免疫低下狀態(tài)下,構(gòu)建白細(xì)胞減少性鮑曼不動桿菌肺炎的動物模型。
　　 方法
　　 45只

13、健康清潔級雄性Sprague—Dawleg大鼠隨機(jī)分為3組:空白組、白細(xì)胞減少組及模型組(各組n=15),模型組接種細(xì)菌前4d及接種前1d分別腹腔注射環(huán)磷酰胺45 mg/kg和肌肉內(nèi)注射地塞米松90 mg/kg,之后采用氣管內(nèi)滴注1.2×109CFU/ml多耐鮑曼不動桿菌懸液。免疫抑制組及空白對照組分別往氣管內(nèi)滴注相同劑量的滅菌生理鹽水。動態(tài)觀察動物活動度、飲水及進(jìn)食情況,同時觀察肺組織濕干比(W/D)、細(xì)菌學(xué)檢查、病理變化并進(jìn)行組間比

14、較。鮑曼不動桿菌引物參考Chen TL等引物1:ITSF(5￠—CATTATCAC GGTAATTAGTG),ITSB(5￠-AG AGCACTGTGCACTTAAG),擴(kuò)增鮑曼不動桿菌的16sRNA基因的間隔區(qū)域,片段長約208 bp；引物2:rAl(5￠—CCTGAATCTTCTGGTAAA AC),rA2(5￠—GTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC),擴(kuò)增不動桿菌屬的高度保守序列,片段長約425bp。上述引物均由上海英俊

15、公司合成。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,計(jì)數(shù)資料采用重復(fù)測量比較分析。
　　 結(jié)果
　　 模型組大鼠滴注鮑曼不動桿菌懸液后6h,開始出現(xiàn)明顯活動度、飲水及進(jìn)食減少。白細(xì)胞減少組及模型組在接種后濕干比均比同期對照組高(P<0.05),白細(xì)胞減少組在接種細(xì)菌后第7d濕干比降至正常,而模型組仍較正常顯著增高,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)菌學(xué)檢查:模型組大鼠肺組織在注射細(xì)菌后6h、20h、36h及7d等

16、各時間點(diǎn)培養(yǎng)均可見細(xì)菌生長,PCR鑒定結(jié)果提示均有鮑曼不動桿菌生長,而其它各組肺組織均未見細(xì)菌生長。模型組大鼠接種細(xì)菌6h后即可見肺組織內(nèi)出血,彈性降低,H—E染色切片可見大量炎癥細(xì)胞滲出,間質(zhì)水腫、增寬,隨著時間延長逐漸加重,至第7天后炎癥稍微減輕,其它各組在生理鹽水氣管內(nèi)滴入6h后肉眼見肺組織均為淡白色,彈性良好,肺部病理切片見少量滲出,隨時間延長,迅速減輕、恢復(fù)。
　　 結(jié)論
　　 通過氣管內(nèi)滴注方式可以成功構(gòu)建白