豬急慢性弓形蟲(chóng)感染ELISA鑒別診斷方法的研究與初步應(yīng)用.pdf

1、弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmosis)是由細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)龔地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)引起的一種人獸共患病。弓形蟲(chóng)病呈世界性分布，在人、家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物中廣泛傳播，據(jù)估計(jì)全球有超過(guò)1/3的人感染弓形蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)感染一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，大多數(shù)被感染者可以終生攜帶組織包囊而不呈現(xiàn)任何臨床癥狀。然而，對(duì)一些免疫抑制病人，例如艾滋病人和惡性腫瘤患者，弓形蟲(chóng)感染卻可以由慢性潛伏感染轉(zhuǎn)化為急性感染從而引起嚴(yán)重的后果，甚至威脅

2、患者的生命。人類(lèi)感染弓形蟲(chóng)主要因?yàn)橥ㄟ^(guò)食物和飲水?dāng)z入了孢子化卵囊或組織包囊，而豬肉正是組織包囊最重要的肉食性來(lái)源。中國(guó)是養(yǎng)豬業(yè)大國(guó)，同時(shí)也是豬肉消費(fèi)大國(guó)。因此迫切需要一種方法能夠?qū)y帶組織包囊的牲豬進(jìn)行快速的鑒別診斷，從而為弓形蟲(chóng)病的預(yù)防和控制創(chuàng)造條件。
　　 本研究利用原核表達(dá)方法獲得了兩種重組蛋白，即緩殖子特異性蛋白BAG1和速殖子特異性蛋白SAG1，并建立了兩種間接ELISA方法rBAG1-間接ELISA和rSAG-間接E

3、LISA。使用這兩種間接ELISA方法并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立的rMIC3-間接ELISA方法，可以對(duì)弓形蟲(chóng)慢性感染的豬進(jìn)行很好的鑒別診斷。
　　 (1)通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了Pru株弓形蟲(chóng)BAG1基因完整的CDS序列(690bp)，并構(gòu)建了BAG1基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-BAG1，實(shí)現(xiàn)了BAG1的原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約32kD，經(jīng)Western-blot證實(shí)此表達(dá)產(chǎn)物能夠被特異的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性豬血清識(shí)別，證明此原

4、核表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　 (2)通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了RH株弓形蟲(chóng)SAG1基因，并構(gòu)建了SAG1基因部分序列(855bp)的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SAG1，實(shí)現(xiàn)了SAG1的原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約35kD，經(jīng)Western-blot證實(shí)此原核表達(dá)產(chǎn)物能夠被特異的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性豬血清識(shí)別，證明此原核表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　 (3)建立了rBAG1-間接ELISA方法，最佳蛋白濃度1:200，

5、最佳血清稀釋度1:100，最佳BSA濃度1.00%，最佳封閉時(shí)間30min，最佳血清作用時(shí)間30min，最佳二抗?jié)舛葹?:7000，最佳二抗作用時(shí)間60min，陰陽(yáng)性臨界值為OD630=0.38。
　　 (4)構(gòu)建了rSAG1-間接ELISA方法，最佳蛋白濃度1:200，最佳血清稀釋度1:100，最佳BSA濃度1.00%，最佳封閉時(shí)間60min，最佳血清作用時(shí)間30min，最佳二抗?jié)舛葹?:6000，最佳二抗作用時(shí)間60min，