環(huán)孢素A-pH敏感性納米粒的藥代動力學研究.pdf

1、目的：本文制備環(huán)孢素A-pH敏感性納米粒(cyclosporine A-loaded pH-sensitive nanoparticles，CyA-NP)及其凍干粉末(Freeze-dried CyA-NP，F(xiàn)d-CyA-NP)二種劑型，建立高效液相色譜(HPLC)法和高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)法測定二種制劑的體內生物樣品中CyA的藥物濃度，旨在研究CyA-NP在體內的吸收、分布、代謝和排泄，為其進一步研究與開發(fā)提供

2、科學依據。
　　 方法：(1)CyA-NP和Fd-CyA-NP的制備及質量評價：應用乳化-溶劑擴散技術制備CyA-NP，通過真空冷凍干燥法制備其凍干粉末制劑。透射電鏡觀察納米粒的表面形態(tài)；動態(tài)激光散射法測定平均粒徑與粒度分布；HPLC法測定兩種納米粒制劑的包封率和載藥量。(2)小鼠血液及各組織中CyA含量HPLC測定方法的建立及CyA-NP的組織分布及靶向性研究：以市售新山地明微乳制劑(Neoral)為參比制劑，小鼠單劑量灌胃給

3、予兩種制劑，采用液-液萃取法處理生物樣品，環(huán)孢素D(cyclosporine D，CyD)為內標，HPLC法測定血液和各組織中藥物濃度，以藥動學參數(shù)(AUC，AUQ，Cmax，Tmax)和靶向參數(shù)(Te，RTe，TI)為評價指標。(3)犬血液中CyA含量HPLC測定方法的建立及Fd-CyA-NP的藥代動力學研究：以雙周期交叉隨機試驗設計法，六只家犬單劑量口服給予Fd-CyA-NP和Neoral，HPLC法測定CyA血藥濃度，采用3P97

4、軟件計算藥動學參數(shù)。(4)大鼠糞便及尿液中CyA含量HPLC-MS/MS測定方法的建立及CyA-NP的體內代謝研究：SD大鼠灌胃給予CyA-NP后，于不同時間段收集尿樣及糞樣，液-液萃取處理，正離子檢測模式下，選擇離子m/z1225→m/z1112(CyA)和m/z1239→m/z1099(CyD)進行多重反應檢測（MRM），HPLC-MS/MS法測定樣品中CyA含量，并根據代謝產物的相對分子質量及質譜行為，鑒定并闡述其結構。(5)大鼠

5、肝微粒體中CyA含量HPLC測定方法的建立及CyA-NP的體外酶促動力學研究：差速離心法制備大鼠肝微粒體，Lowry法測定肝微粒體蛋白濃度，考察孵育時間、酶濃度和底物濃度對藥物代謝速率的影響，并根據Lineweave-Brurk雙倒數(shù)曲線，計算酶促動力學參數(shù)。
　　 結果：(1)CyA-NP和Fd-CyA-NP的平均粒徑分別為43.9±0.8nm、52.7±4.6nm。包封率均高達99％左右，載藥量分別為(23.9±0.1)%、

6、(22.9±0.2)%。納米粒子均呈規(guī)則的圓球形。(2)小鼠血液及組織中CyA含量HPLC測定方法的回收率均大于72%，日內、日間精密度良好，該方法符合生物樣品分析的要求。經3P97軟件擬合，兩種制劑在小鼠體內藥代動力學均符合口服吸收二室模型，CyA-NP的相對生物利用度為162.5%，體內藥物濃度分布趨勢為肝臟＞心臟＞腎臟＞脾臟＞肺臟，與Neoral相比，有一定的腎臟和心臟趨向性，在肝臟中無蓄積。(3)犬血液中CyA含量HPLC測定方

7、法的回收率均大于94%，日內、日間精密度均小于10%，該方法符合生物樣品分析的要求。經3P97軟件擬合，兩種制劑的藥代動力學過程均符合二室模型。與Neoral相比，F(xiàn)d-CyA-NP的AUC顯著增大(P＜0.05)，CL(s)顯著降低(P＜0.05)，相對生物利用度為135.9%。(4)大鼠排泄物中CyA含量HPLC-MS/MS測定方法的回收率均大于80%，日內及日間精密度小于8%，準確度在±15%范圍內?？诜o藥84h后，在尿液及糞便

8、中CyA累積排泄量分別為6.48±1.29μg、625.80±289.08μg，大鼠糞便中檢測到甲基化、羥基化和二羥基化代謝產物共七種，而尿樣中有六種。(5)大鼠肝微粒體中CyA含量HPLC測定方法的回收率大于87%，日內、日間精密度均小于10%，該方法符合生物樣品分析的要求。肝內清除率(CLint)比較，原料藥組要大于CyA-NP組(P＜0.05)，而最大反應速率(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)無明顯差異(P＞0.05)。孵育90min

9、后，原料藥組藥物代謝率(1.049±0.028μg·mL-1)高于CyA-NP(0.874±0.023μg·mL-1)(P＜0.05)。
　　 結論：建立的生物樣品中CyA含量HPLC和HPLC-MS/MS測定方法靈敏、簡便、重現(xiàn)性好，適用于生物樣品中CyA濃度檢測及藥代動力學研究。CyA-NP體內組織分布及代謝廣泛，促進了藥物口服吸收，顯著提高了CyA的生物利用度。研究結果顯示，這種新型pH敏感性納米藥物輸送系統(tǒng)具有良好的開發(fā)