‘津田’蕪菁UV-A誘導(dǎo)的泛素化相關(guān)基因BrUBC1和BrRUB1的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期在研究‘津田’蕪菁(Brassica rapa Tsuda’)根皮花青素的合成中發(fā)現(xiàn),各種光質(zhì)中只有UV-A能特異誘導(dǎo)‘津田’蕪菁根皮花青素的合成,可能存在UV-A特異誘導(dǎo)花青素合成的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；在差異蛋白組學(xué)篩選鑒定特定的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子過(guò)程中還發(fā)現(xiàn),UV-A光照處理后兩種泛素化相關(guān)蛋白質(zhì)增量表達(dá)。那么這兩種蛋白是否參與了‘津田’蕪菁中UV-A特異誘導(dǎo)花青素合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)呢?為此,本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,針對(duì)這兩個(gè)UV

2、-A誘導(dǎo)下差異表達(dá)的泛素化相關(guān)蛋白UBC和RUB進(jìn)行了基因克隆以及相關(guān)表達(dá)分析,研究其在‘津田’蕪菁不同組織和不同UV-A光照時(shí)間段后的表達(dá)特性,并構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體,對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化擬南芥,研究這兩個(gè)泛素化相關(guān)基因的過(guò)量表達(dá)是否影響花青素的合成,以篩選鑒定UV-A特異誘導(dǎo)的花青素合成相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,這為進(jìn)一步研究‘津田’蕪菁花青素合成受UV-A光誘導(dǎo)的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 (1)從‘津田’蕪菁中克

3、隆到了兩個(gè)UV-A誘導(dǎo)下增量表達(dá)的泛素化相關(guān)基因,分別命名為BrUBC1、BrRUB1。Southern雜交檢測(cè)顯示BrUBC1、BrRUB1在‘津田’蕪菁基因組中有個(gè)6個(gè)拷貝和5個(gè)拷貝。生物信息學(xué)方法分析表明,BrUBC1是泛素結(jié)合酶E2家族的成員,BrRUB1是泛素類似蛋白。此外,還繪制了這兩個(gè)基因的進(jìn)化樹(shù),確定其進(jìn)化地位。
　　 (2)BrUBC1和BrRUB1的表達(dá)特性分析
　　 通過(guò)Real-time PCR的

4、方法定量分析表明:‘津田’蕪菁膨大直根表皮不見(jiàn)光處的白色表皮部分BrUBC1比植株地上接受光照的各個(gè)部分的表達(dá)都要低,表明BrUBC1的表達(dá)是依賴光的。單獨(dú)對(duì)白皮進(jìn)行UV-A照射后發(fā)現(xiàn),1 h的UV-A照射使BrUBC1表達(dá)顯著增加。白皮中BrRUB1的表達(dá)也受UV-A光誘導(dǎo),長(zhǎng)于1 h的UV-A照射使其表達(dá)量增加,但BrRUB1的高表達(dá)局限于花中,在根皮以及葉子中的表達(dá)及低。BrUBC1和BrRUB1的表達(dá)確實(shí)受UV-A光誘導(dǎo)。

5、>　　 通過(guò)構(gòu)建基因的亞細(xì)胞定位載體并在洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),在激光共聚焦顯微鏡下觀察到融合蛋白GFP-BrUBC1和GFP-BrRUB1定位于細(xì)胞核中。
　　 (3)BrUBC1和BrRUB1基因轉(zhuǎn)化擬南芥的研究
　　 通過(guò)Gateway技術(shù)將BrUBC1和BrRUB1基因構(gòu)建到過(guò)量表達(dá)載體pH7WG2D上,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥花絮真空滲透法,用于擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化以研究基因的功能,利用潮霉素篩選種子法,獲得了多