乙型肝炎病毒核心基因內(nèi)部缺失突變體的篩查及其對非折疊蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景：
　　HBV是高變異的DNA病毒，其基因組是長約3.2 kb的部分雙鏈環(huán)狀DNA分子。HBV基因組上的變異包括點(diǎn)突變、缺失突變和移碼突變等。缺失突變可發(fā)生在基因組不同編碼框架中，HBV核心基因的內(nèi)部缺失（core internal deletion, CID）突變體也有報(bào)道。HBV CID突變體可能改變HBV的生物學(xué)及致病性質(zhì)。因此，調(diào)查江西地區(qū)慢性乙肝感染者的HBV CID突變體的流行情況，分析其基本生物學(xué)性質(zhì)，對于進(jìn)

2、一步認(rèn)識HBV致病性有重要意義。
　　研究目的：
　　初步研究江西地區(qū)慢性乙型肝炎患者HBV CID突變體的流行率，闡明HBV CID突變體的分子特征。構(gòu)建HBV CID突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，觀察HBV CID突變體表達(dá)產(chǎn)物的分泌特征，并初步闡述HBV CID突變體對宿主細(xì)胞非折疊蛋白反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步認(rèn)識HBV致病的復(fù)雜性。研究方法：
　　1.于2014,10-2015,6，從南昌大學(xué)

3、第二附屬醫(yī)院門診檢驗(yàn)科收集189例慢性乙型肝炎患者HBsAg陽性血清作為研究材料，提取病人血清中的HBV DNA。
　　2.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBV基因組中長約840 bp的C基因DNA片段，命名為HBV-C，其包含 EnhII+BCP+PreC+C基因，產(chǎn)物電泳，目的條帶回收、純化并進(jìn)行測序。
　　3.利用Clustal X和Bioedit軟件將所獲得的HBV C區(qū)基因核苷酸和氨基酸序列與參考序列進(jìn)行比對，分析缺失突變位點(diǎn)

4、，以及HBV CID突變株的流行率。
　　4.選取一例含有CID突變的變異株，PCR大量擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳，收集標(biāo)準(zhǔn)片段和缺失片段，將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1中，構(gòu)建真核表達(dá)載體pBudCE4.1-HBV-C和pBudCE4.1-HBV-CID，雙酶切及測序鑒定。
　　5.質(zhì)粒pBudCE4.1-HBV-C、pBudCE4.1-HBV-CID以及pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液以

5、及細(xì)胞裂解液，ELISA檢測其中HBeAg的表達(dá)。
　　6.提取pBudCE4.1-HBV-C、pBudCE4.1-HBV-CID以及pBudCE4.1DNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后24 h、48 h和72 h時(shí)相點(diǎn)的總RNA，RT-PCR檢測與非折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白ATF4、ATF6、XBP1-s和GRP78的mRNA的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.189份的 HBsAg陽性感染者的平均年齡為48±6.51歲，男性10

6、2人（53.97％），女性87人（46.03%）。
　　2. HBV C區(qū)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，7例標(biāo)本中擴(kuò)增出含840 bp和700 bp左右大小的二條帶，序列比對發(fā)現(xiàn)840 bp產(chǎn)物為完整 C區(qū)基因，即含EnhII-BCP-PreC-C基因的完整序列，而700 bp產(chǎn)物出現(xiàn)了C區(qū)基因內(nèi)部缺失突變，為HBV CID突變體。
　　3. HBV CID突變體序列與HBV C區(qū)基因序列比對結(jié)果顯示，7例HBV CID突變體的缺

7、失區(qū)域分別位于 nt2152-2265、nt2132-2239、nt2163-2306、nt2179-2283、nt2131-2247、nt2151-2252、nt2180-2203/nt2255-2332。
　　4.7例HBV CID突變體氨基酸缺失區(qū)域分別位于aa84-121、aa78-113、aa89-136、aa94-128、aa78-116、aa84-117、aa94-101/aa119-144，分別導(dǎo)致b1/b2/c2

8、/t3、b1/b2/c2/t3、b1/b2/b3/c2/t3、b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3、b1/b2/c2/t3和b3/c2/t3免疫位點(diǎn)的丟失。
　　5.質(zhì)粒DNA雙酶切及DNA測序結(jié)果證實(shí)，重組質(zhì)粒pBudCE4.1-HBV-C和pBudCE4.1-HBV-CID構(gòu)建成功，分別攜帶有840 bp和700 bp大小的目的基因。
　　6. ELISA檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 HepG2細(xì)胞中 HBeAg表達(dá)結(jié)果顯示， p

9、BudCE4.1-HBV-C組的細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中HBeAg的表達(dá)量最高，顯著高于 pBudCE4.1空載體組和 pBudCE4.1-HBV-CID轉(zhuǎn)染組（ P<0.05）。pBudCE4.1-HBV-CID轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞裂解液中可檢測到較低水平的HBeAg表達(dá)，在培養(yǎng)液中未檢測到HBeAg表達(dá)。
　　7. RT-PCR結(jié)果顯示，pBudCE4.1-HBV-CID組的ATF4、ATF6、XBP1-s、GRP78基因mRNA的表

10、達(dá)量顯著高于pBudCE4.1對照組和pBudCE4.1-HBV-C組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.江西地區(qū)慢性乙肝患者中存在HBV CID突變體的流行，初步調(diào)查結(jié)果顯示流行率為3.7%。
　　2.在本地區(qū)發(fā)現(xiàn)的HBV CID突變體的缺失為編碼框架內(nèi)缺失，缺失區(qū)域主要位于nt2131-2306區(qū)域。
　　3. HBV CID突變體（aa78-136）可能會導(dǎo)致某些具有免疫優(yōu)勢的表位缺失，從而造成免疫逃避