乙型肝炎病毒X蛋白突變體致癌作用及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)與肝癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),乙肝病毒X開(kāi)放讀碼框編碼的X蛋白(HBx)作為反式激活因子在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。但是,HBx致癌作用的分子機(jī)理仍不十分清楚。在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)HBx基因普遍存在點(diǎn)突變和缺失突變,頻率高達(dá)70％,但其作用不清。本研究為了進(jìn)一步闡明HBx及其突變體在肝癌細(xì)胞中的作用和分子機(jī)制,從信號(hào)傳導(dǎo)途徑等方面探討了野生型HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制；

2、應(yīng)用PCR技術(shù)從肝癌患者的癌組織和癌旁組織中篩選新的X基因突變體,并對(duì)已發(fā)現(xiàn)的HBx羧基端缺失突變體(命名為HBx△127)促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制進(jìn)行深入細(xì)致的研究。本文從以下三個(gè)方面對(duì)HBx作用的分子機(jī)制進(jìn)行了研究,主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 第一部分：HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究。探討了5-脂氧合酶(5-lipoxygenases,5-LOX)在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖中的作用。應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)HBx的人肝癌細(xì)胞系He

3、pG2-Ⅹ和H7402-Ⅹ,通過(guò)real-time PCR、免疫印跡和酶聯(lián)免疫分析等方法檢測(cè)5-LOX表達(dá)水平,結(jié)果顯示HBx能夠上調(diào)5-LOX的表達(dá),其細(xì)胞培養(yǎng)液中5-LOX代謝產(chǎn)物L(fēng)IB4的含量增加；在此基礎(chǔ)上,探討HBx上調(diào)5-LOX表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果顯示,Nuclearfactor-kappa B(NF-kB)的特異性抑制劑PDTC和NF-kB siRNA干擾片段可明顯降低5-LOX的表達(dá),表明HBx通過(guò)NF-kB上調(diào)了5-L

4、OX的表達(dá)；然后,應(yīng)用5-LOX的特異性抑制劑MK886和5-LOX siRNA處理HepG2-Ⅹ(or H7402-Ⅹ)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)5-LOX通過(guò)正反饋促進(jìn)NF-kB的表達(dá)。因此,本研究結(jié)果提示,HBx通過(guò)5-LOX和NF-kB之間的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)促進(jìn)和維持肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 第二部分：新的乙肝病毒X基因突變體的篩選。為了發(fā)現(xiàn)新的HBx基因突變,我們從60例肝癌病人的癌組織和癌旁組織中篩選HBx基因新的突變體。結(jié)果顯示,44例

5、癌組織和癌旁組織里均可檢測(cè)到HBx基因,陽(yáng)性率為73.3％；其中28例癌組織中HBx基因發(fā)生了突變(63.6％),27例的癌旁組織里HBx基因發(fā)生突變(61.3％)；測(cè)序結(jié)果顯示,癌組織和癌旁組織中HBx點(diǎn)突變分別有35種不同類(lèi)型,其中癌組織中HBx蛋白第30,33,38,144位氨基酸為熱點(diǎn)突變位點(diǎn),而第30,33和38位氨基酸伴隨有組合突變(突變率30％),該突變體目前未見(jiàn)報(bào)道；癌旁組織中HBx蛋白的第31,40,87,94位氨基酸

6、為熱點(diǎn)突變位點(diǎn),第94位氨基酸點(diǎn)突變(突變率11％)目前未見(jiàn)報(bào)道。在此基礎(chǔ)上,對(duì)癌組織中發(fā)現(xiàn)的HBx組合突變體的功能進(jìn)行了初步研究,通過(guò)報(bào)告基因檢測(cè)了上述HBx組合突變體對(duì)NF-k3、hTERT、AP-1和survivin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響,結(jié)果顯示第30,33和38位HBx的組合突變體與野生型的HBx蛋白結(jié)果相同,提示該組合突變并未影響其功能改變。
　　 第三部分：HBx突變體HBx△127促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖信號(hào)途徑研究。我們

7、實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)HBx△127與野生型HBx相比具有更強(qiáng)的促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的能力,但其分子機(jī)制尚不清楚。為了探討HBx△127在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,本研究首先應(yīng)用人肝癌細(xì)胞系HepG2和H7402,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染和G-418篩選等方法,獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx△127的肝癌細(xì)胞系,分別將其命名為HepG2-X△127和H7402-X△127；在此基礎(chǔ)上,探討了HBx△127對(duì)脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)

8、和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol regulatoryelement binding protein1c,SREBP-1c)的影響。應(yīng)用real-time PCR、熒光素酶報(bào)告基因、免疫印跡和酶聯(lián)免疫分析等方法,發(fā)現(xiàn)HBx△127能夠上調(diào)FAS和SREBP-1c的啟動(dòng)子活性及SREBP-1c的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),5-LOX的特異性抑制劑MK886可明顯抑制上述上調(diào)作用,提示HBx△127可通過(guò)5-LOX上調(diào)FAS的轉(zhuǎn)錄活性和

9、SREBP-1c的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；然后,我們進(jìn)一步觀察了HBx△127對(duì)5-L-OX代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4的影響。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)HepG2-X△127和H7402-X△127細(xì)胞條件培養(yǎng)液中LTB4的含量與對(duì)照細(xì)胞組相比明顯增加。當(dāng)在培養(yǎng)液中外加100nM LTB4時(shí),熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,FAS的啟動(dòng)子活性明顯增強(qiáng)。最后,應(yīng)用FAS的特異性抑制劑cerulenin處理HepG2-X△127