miR-200a調(diào)控β-catenin在腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的:
　　本課題用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，觀察miR-200a和β-catenin的表達變化;用雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實miR-200a以β-catenin的基因CTNNB1為靶標;以外源性干預(yù)miR-200a的表達，觀察其對β-catenin和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響;用干擾RNA阻斷β-catenin表達，反證β-catenin在miR-200a調(diào)控小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的重要作用。確立miR-200a直接以

2、β-catenin為靶點調(diào)控小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。這為干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生提供了新的實驗依據(jù)，為腎間質(zhì)纖維化的治療提供新靶點。
　　方法:
　　1.TGF-β1誘導(dǎo)對體外培養(yǎng)HK-2細胞miR-200a和β-catenin的影響，將HK-2細胞，分為0h組、12h組、24h組、48h組，用終濃度為10ng/ml的TGF-β1分別作用12h、24h、48h; qPCR檢測各組miR-200a的表達，qPCR和Western B

3、lot檢測各組HK-2細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況。
　　2.agomir(miR-200a激動劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對HK-2細胞miR-200a表達的影響，HK-2細胞分為4組，48h后qPCR檢測miR-200a的表達情況。
　　3.運用雙熒光素酶報告質(zhì)粒（β-catenin基因野生型/突變型，CTNNB1 UTR WT/MT）驗證m

4、iR-200a與β-catenin的作用靶點關(guān)系，HK-2細胞分為4組，48h后雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光活性。
　　4.上調(diào)miR-200a(agomir)對TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin及小管EMT的影響，HK-2細胞分為4組，48h后qPCR和Western Blot檢測細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況，細胞免疫熒光檢測E-cadherin和α-SMA的表達情況。

5、
　　5.下調(diào)miR-200a(antagomir)對β-catenin及小管EMT的影響，HK-2細胞分為3組，48h后qPCR和WesternBlot檢測細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況，細胞免疫熒光檢測E-cadherin和α-SMA的表達情況。
　　6.β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對細胞β-catenin的影響，HK-2細胞分為3組，各組細胞培養(yǎng)至48h進行

6、qPCR和Western Blot檢測β-catenin表達。
　　7.干擾β-catenin對antagomir誘導(dǎo)的EMT的影響，HK-2細胞分為4組，48h后qPCR和Western Blot檢測細胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β1誘導(dǎo)下細胞miR-200a、β-catenin及轉(zhuǎn)分化指標的表達情況qPCR檢測結(jié)果示miR-200a在0h組呈高表達

7、，提示在TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中miR-200a表達下調(diào)，而β-catenin表達上調(diào)。
　　2.agomir(miR-200a激動劑)和antagomir(miR-200a抑制劑)對HK-2細胞miR-200a表達的影響
　　qPCR檢測結(jié)果示，miR-200a的表達在NC-miRNA組與control組無明顯差別(P＞0.05);在agomir組miR-200a表達較NC-miRNA組明顯增多(P＜0.05)

8、，在antagomir組其表達較NC-miRNA組明顯減少(P＜0.05)。提示agomir上調(diào)miR-200a表達，antagomir下調(diào)miR-200a表達。
　　3.雙熒光素酶實驗檢測miR-200a與β-catenin的作用靶點
　　雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR MT質(zhì)粒的各組間相對熒光活性比值無明顯差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染CTNNB1 UTR WT質(zhì)粒的各組，control組和NC-miRNA

9、組無明顯差異，但在antagomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯升高(P＜0.05)，在agomir組熒光活性比值較NC-miRNA組明顯降低(P＜0.05)。提示miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標。
　　4.上調(diào)miR-200a(agomir)對TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin及小管EMT的影響
　　細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表

10、達在TGF-β1組和NC-miRNA+TGF-β1組之間無明顯差異(P＞0.05);在TGF-β1組，β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達較control組明顯增多(P＜0.05)，E-cadherin的mRNA和蛋白表達較control組明顯減少(P＜0.05);在agomir+TGF-β1組，β-catenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達較NC-miRNA+TGF-β1組明顯下調(diào)(P＜0.05)，同時較

11、TGF-β1組明顯下調(diào)(P＜0.05)，E-cadherin的mRNA和蛋白表達則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯上調(diào)(P＜0.05)，同時較TGF-β1組明顯上調(diào)(P＜0.05)。細胞免疫熒光結(jié)果與蛋白結(jié)果一致，即E-cadherin熒光在TGF-β1組較control組顯著減弱，在agomir+TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組明顯增強;α-SMA熒光在TGF-β1組較control組明顯增強，在agomir+

12、TGF-β1組則較NC-miRNA+TGF-β1組顯著減弱。提示上調(diào)miR-200a減弱TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin表達，抑制小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化
　　5.下調(diào)miR-200a(antagomir)對β-catenin及小管EMT的影響
　　細胞β-catenin、E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達在control組與在NC-miRNA組無明顯差別(P＞0.05);在antagomir組，β-c

13、atenin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達較NC-miRNA組明顯升高(P＜0.05); E-cadherin的mRNA和蛋白表達則較NC-miRNA組明顯降低(P＜0.05)。細胞免疫熒光顯示，在control組和NC-miRNA組，E-cadherin出現(xiàn)明顯紅色熒光，α-SMA則有少許微弱的熒光;在antagomir組E-cadherin熒光明顯減弱，α-SMA熒光顯著增強。提示下調(diào)miR-200a可增加β-catenin

14、表達，促進小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
　　6.β-catenin siRNA對細胞β-catenin表達的影響
　　在control組和NC-siRNA組β-catenin的mRNA表達無明顯差別(P＞0.05)，但在siR-β-catenin組，β-catenin表達較NC-siRNA組明顯下調(diào)(P＜0.05); Western Blot結(jié)果與qPCR結(jié)果相符，即β-catenin表達在control組和NC-siRNA組正常表

15、達，但在siR-β-catenin組較NC-siRNA組表達顯著減少(P＜0.05)。提示β-catenin siRNA抑制β-catenin表達。
　　7.干擾β-catenin對antagomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響
　　細胞E-cadherin、α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達在antagomir組與antagomir+NC-siRNA組無明顯差異(P＞0.05);在antagomir組，E-cadher

16、in的mRNA和蛋白表達較control組顯著減少(P＜0.05)，α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達則較control組顯著增加;在antagomir+siR-β-catenin組，E-cadherin的mRNA和蛋白表達較antagomir+NC-siRNA組表達上調(diào)(P＜0.05);α-SMA和FN的mRNA和蛋白表達則較antagomir+NC-siRNA組表達下調(diào)(P＜0.05)。提示β-catenin siRNA抑制ant

17、agomir誘導(dǎo)的小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，反證了miR-200a直接調(diào)控β-catenin影響腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化
　　結(jié)論:
　　1.在TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中miR-200a表達下調(diào)，而β-catenin表達上調(diào);
　　2.miR-200a直接以β-catenin的基因CTNNB1為靶標;
　　3.上調(diào)miR-200a減弱TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin表達，抑制小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;下調(diào)miR-2