HSP47在腎小管上皮細胞轉分化中的作用與機制研究.pdf

1、背景：腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)進展到終末期腎臟疾病(end stagerenal disease，ESRD)的共同通路和最主要病理改變之一。大量動物及臨床實驗表明，在各種原發(fā)和繼發(fā)性。腎臟疾病中，腎間質纖維化程度比腎小球硬化程度與腎功能的關系更為密切，是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后最重要的指標。腎小管上皮細胞轉

2、分化(epithelialto mesenchymal transition，EMT)是腎間質纖維化的早期且可逆階段，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積是腎間質纖維化的主要組織學改變。研究表明轉化生長因子-β1(transforming growth factor，TGF-β1)在這一過程中起關鍵作用。TGF-β1/Smad2-3信號通路是TGF-β1誘導腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積的主要途徑。

3、>　　 熱休克蛋白47(heat shock protein47，HSP47)是熱休克蛋白家族的一種膠原特異性分子伴侶，能與多種類型的膠原和前膠原特異性結合，調控膠原的表達，在多種器官纖維化過程中起重要作用。研究顯示HSP47過度表達與腎臟纖維化密切相關，并成為腎臟纖維防治的目標之一。HSP47主要表達于表型轉化的腎小管上皮細胞，受TGF-β1調控，抑制HSP47表達能夠減輕腎臟纖維化。腎小管上皮細胞EMT過程中伴有熱休克蛋白亞族的產

4、生，而熱休克蛋白參與EMT的研究目前尚不多，基于以上分析，我們認為HSP47可能與慢性腎臟疾病腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積有關。因此，本實驗從體內體外兩方面研究腎小管上皮細胞EMT中HSP47的作用，并進一步闡述其可能的作用機制。
　　 第一章：HSP47在UUO模型大鼠中的表達及其對腎小管上皮細胞轉分化的影響
　　 目的：闡明HSP47在UUO模型大鼠腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積中的作用，探討以HSP47為靶點

5、抑制腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積的策略。
　　 方法：12周齡SD雄性大鼠，體重280～320g。隨機分為假手術組(Sham組)、UUO模型組(UUO組)、UUO模型+超聲聯合脂質微泡+HSP47反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，antisenseODNs)組(antisenseODNs組)以及UUO模型+超聲聯合脂質微泡+HSP47正義寡核苷酸(sense oligonucleotides

6、，senseODNs)組(senseODNs組)。每組18只，再隨機分為3天組，7天組，14天組三個亞組(每組6只)。按分組于第3、7和14天處死大鼠，取結扎側腎臟。運用HE、Masson染色觀察各組大鼠腎臟組織形態(tài)學改變，采用免疫組化方法檢測UUO組大鼠不同時間腎臟組織HSP47、波形蛋白(Vimentin)、緊密連接蛋白(Zona occludens-1，ZO-1)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)的表達，運用Western

7、 blot及Real-time PCR檢測各組大鼠14天時各組大鼠腎臟組織HSP47、ZO-1、Vimentin、ColⅠ的表達。
　　 結果：HE和Masson染色顯示，與Sham組相比，UUO組大鼠隨梗阻時間延長，腎小管損傷程度、間質纖維化程度及炎癥細胞浸潤逐漸增加(p<0.05)。與UUO組相比，antisenseODNs組上述病變程度較同時間UUO組減輕(p<0.05)，senseODNs組無明顯差別(p>0.05)。免

8、疫組化顯示，與Sham組相比，UUO組大鼠隨梗阻時間的延長腎臟組織HSP47、Vimentin、ColⅠ表達上調(p<0.05)，而ZO-1表達下調(p<0.05)。與Sham組相比，14天時antisenseODNs組HSP47蛋白及mRNA表達明顯降低(p<0.05)，同時ZO-1蛋白及mRNA表達上調(p<0.05)，Vimentin、ColⅠ蛋白及mRNA表達下調(p<0.05)，纖維化程度減輕；senseODNs組HSP47、

9、ZO-1、Vimentin、ColⅠ蛋白及mRNA表達無明顯變化(p>0.05)。
　　 結論：UUO模型大鼠腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積過程中，HSP47表達上調；抑制HSP47表達能部分逆轉腎小管上皮細胞EMT，抑制ECM生成。
　　 第二章：HSP47在腎小管上皮細胞中的表達及其對TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化的影響
　　 目的：闡明HSP47在TGF-β1誘導的HK-2細胞EMT及ECM沉積中

10、的作用，探討以HSP47為靶點抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞EMT及ECM沉積的策略。
　　 方法：用10ng/ml TGF-β1刺激HK-2細胞(TGF-β1組)，通過細胞免疫熒光、Western blot及Real-time PCR檢測HSP47、Vimentin、ZO-1的表達，通過Western blot及Real-time PCR檢測Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)和Ⅳ型膠原(CollagenⅣ，ColⅣ)

11、的表達；轉染HSP47 siRNA(HSP47siRNA組)及HSP47陰性對照組(HSP47siRNA(-)組)，陰性對照為無基因抑制效果的一段siRNA，再予TGF-β1刺激，通過細胞免疫熒光、Western blot檢測HSP47表達，通過Western blot、Real-time PCR法檢測HK-2細胞Vimentin、ZO-1、ColⅠ、ColⅣ的表達變化。
　　 結果：10ng/ml TGF-β1刺激后，HK-2

12、細胞Vimentin、ColⅠ和ColⅣ蛋白及mRNA呈時間依賴性表達升高(p<0.05)，ZO-1蛋白及mRNA呈時間依賴性表達降低(p<0.05)，而HSP47蛋白及mRNA也呈時間依賴性表達升高(p<0.05)。與TGF-β1組相比，HSP47siRNA組HK-2細胞HSP47蛋白及mRNA表達明顯下調(p<0.05)，同時ZO-1蛋白及mRNA表達上調(p<0.05)，Vimentin、ColⅠ和ColⅣ蛋白及mRNA表達下調(

13、p<0.05)；HSP47siRNA(-)組ZO-1、Vimentin、ColⅠ和ColⅣ的蛋白及mRNA表達無明顯變化(p>0.05)。
　　 結論：TGF-β1誘導HK-2細胞EMT及ECM沉積過程中伴有HSP47表達升高；下調HSP47可部分逆轉HK-2細胞EMT，抑制ECM生成。
　　 第三章：HSP47通過調節(jié)Smad3的活性參與TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化
　　 目的：闡明HSP47參與調控

14、TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT及ECM沉積的可能機制，為靶向HSP47防治腎臟纖維化提供理論依據。
　　 方法：用10ng/ml TGF-β1刺激HK-2細胞(TGF-β1組)，通過Western blot方法檢測細胞中Smad3、p-Smad3的表達水平；轉染HSP47 siRNA(HSP47siRNA組)及HSP47陰性對照組(HSP47siRNA(-)組)，陰性對照為無基因抑制效果的一段siRNA，再予TGF-β1

15、刺激，通過Western blot方法檢測Smad3、p-Smad3、HSP47的表達變化。
　　 結果：TGF-β1促進Smad3磷酸化，上調p-Smad3/Smad3表達(p<0.05)，在30分鐘時達到峰值，隨后稍下降，在24～48小時達到另一峰值。與TGF-β1組相比，HSP47siRNA組HSP47蛋白表達下降(p<0.05)，同時p-Smad3/Smad3表達下調(p<0.05)；HSP47siRNA(-)組p-Sm