法舒地爾對壓力超負荷大鼠心肌ACE-AngⅡ及ACE2-Ang(1-7)的影響.pdf

1、心室重構是心力衰竭、心肌梗死、高血壓心臟病及心肌病等心臟疾病的病理生理基礎。心肌纖維化是心室重構的重要部分，是指心肌組織中膠原纖維過量沉積，膠原濃度和膠原容積分數(shù)顯著增加，各型膠原比例失調及排列紊亂，與心律失常、心功能障礙甚至心臟性猝死密切相關。心肌纖維化使心肌組織結構紊亂，心室壁僵硬，導致心臟舒縮功能障礙及心律失常。
　　 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，臨床干預RAS已成為治療相關疾病的基石

2、。心臟組織內具有獨立的RAS，能合成RAS幾乎全部的成分。研究表明，組織內RAS而非循環(huán)中RAS是心肌纖維化的關鍵刺激因素，壓力超負荷、心肌梗死、循環(huán)RAS活化等病理性刺激通過升高組織RAS活性而導致細胞肥大、心肌纖維化或心肌細胞凋亡等病理改變。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS主要效應因子，血管緊張素轉化酶(ACE)是其生成的關鍵酶。血管緊張素轉換酶相關羧肽酶(ACE2)是ACE的一種同工酶，二者的催化結構域有大約42％的同源性，在體內

3、與ACE分布一致。ACE2主要將八肽的AngⅡ水解為七肽的Ang(1-7)。Ang(1-7)通過其特異性受體Mas活化或抑制胞內多條信號通路，在胞內信號分子水平上拮抗AngⅡ的作用。故ACE2-Ang(1-7)-Mas軸是ACE-AngⅡ-AT1軸的內源性拮抗體系。
　　 細胞骨架是真核細胞維持其基本形態(tài)的重要結構，為胞內蛋白提供附著支架，參與細胞分裂、生長、物質運輸、遷移、收縮等許多重要的生命活動。Rho激酶是小G蛋白RhoA

4、的下游主要效應因子，被證明是調控細胞骨架重組的重要因子。近來的研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶在心臟疾病中具有重要作用。Rho激酶的活性與心力衰竭患者左室重構和泵血功能障礙程度密切相關。動物實驗表明，Rho激酶特異性抑制劑法舒地爾能顯著減輕壓力負荷、損傷、激素（AngⅡ、醛固酮及異丙腎上腺素等）及糖尿病等因素誘導的心肌細胞肥大、心臟間質纖維化和炎癥浸潤，并能改善收縮性或舒張性心功能障礙。
　　 基于以上背景，Rho激酶有望成為干預心肌纖維化

5、的有效靶點，但是其作用機制還不完全清楚。法舒地爾是目前唯一上市用于臨床的Rho激酶特異性抑制劑。本研究用法舒地爾干預壓力超負荷大鼠，探討Rho激酶抑制劑對心肌ACE-AngⅡ和ACE2-Ang(1-7)的影響，為臨床上將Rho激酶作為抗心室重構新靶點提供更多依據(jù)。
　　 目的:
　　 觀察Rho激酶抑制劑法舒地爾對壓力超負荷大鼠心肌ACE-AngⅡ及ACE2-Ang(1-7)的影響，探討Rho激酶在心肌纖維化中的作用。<

6、br>　　 方法:
　　 雄性SD大鼠50只，體重180±20 g，按隨機表法選取8只大鼠作為假手術組（Sham組），剩余42只按Anversa等所用方法用腹主動脈縮窄術制備壓力超負荷模型。Sham組按上述程序分離腹主動脈，但不予夾閉。4周后，大鼠存活36只，死亡14只，Sham組無死亡。成模大鼠28只，隨機分為:模型對照組(Model組，n=10)、法舒地爾高劑量干預組(FH組，n=9)和法舒地爾低劑量干預組(FL組，n=9

7、)。加上Sham組(n=8)共4組。腹腔注射給予4組大鼠的藥量分別為:0.9％氯化鈉2 ml/kg·d（Sham組）、0.9％氯化鈉2ml/kg·d(Model組)、法舒地爾2 ml/kg·d(FH組，30 mg/kg·d)和稀釋3倍后的法舒地爾2ml/kg·d(FL組，10 mg/kg·d)。藥物干預4周后，稱重，計算心臟重量指數(shù)(HWI)和左室重量指數(shù)(LVWI)。觀察心肌組織HE染色和Masson膠原染色，堿水解法測定心肌羥脯氨酸

8、(HYP)含量，免疫組織化學分析轉化生長因子(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)、磷酸化的MYPT1、ACE和ACE2的蛋白水平，RT-PCR檢測ACE2 mRNA表達，ELISA檢測心肌和血漿AngⅡ及Ang(1-7)的濃度。
　　 統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以(x)±s表示。多個組間比較采用單因素方差分析。兩兩組間多重比較時，方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett'sT3

9、檢驗。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.各組大鼠心肌纖維化指標的比較與Sham組相比，Model組HWI和LVWI顯著增高，心肌HYP含量升高(p＜0.01)，提示大鼠心肌有大量膠原蛋白沉積。與Model組相比，F(xiàn)H組和FL組大鼠HWI、LVWI及心肌HYP含量均有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01或p＜0.05）。
　　 2.各組大鼠心肌組織HE和Masson染色結果Sham

10、組心肌細胞排列整齊，胞質染色均一，無壞死灶，間質膠原纖維增生不明顯。與Sham組相比，Model組心肌細胞增粗、紊亂，可見多個壞死灶，并有炎性細胞浸潤，血管周圍及間質膠原纖維大量沉積。與Model組相比，F(xiàn)H組心肌組織與Sham組相似，心肌細胞情況明顯改善，間質纖維化程度顯著減輕，間質少量膠原纖維沉積;FL組心肌細胞增粗、紊亂，可見壞死灶，少量炎性細胞浸潤，血管及間質仍有膠原纖維沉積，但較Model組減輕。
　　 3.各組大鼠心

11、肌組織p-MYPT水平比較MYPT1是Rho激酶的特異性底物，其磷酸化水平可反映Rho激酶活性。免疫組化染色為棕色提示p-MYPT1表達陽性。Sham組棕色區(qū)域散在，整體淡染;Model組棕色區(qū)域顯著增多，切片深染;FH組棕色區(qū)域較Model組顯著減少，整體著色與Sham組相近;FL組棕色區(qū)域較Model組減少，但染色較Sham組稍深。半定量分析結果顯示，與Sham組相比，Model組p-MYPT1的MOD顯著升高(p＜0.01);與M

12、odel組相比，F(xiàn)H組和FL組MOD均有顯著降低(p＜0.01)。
　　 4.各組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF水平比較Sham組TGF-β1免疫染色較淺，棕色區(qū)域很少;Model組染色顯著加深，棕色區(qū)域顯著增多;FH組棕色區(qū)域較Model組顯著減少，整體顏色較Sham組稍深;FL組棕色面積及顏色介于Model組和FH組之間。半定量分析顯示，Model組TGF-β1的MOD值較Sham組顯著升高(p＜0.01);FH組和FL

13、組MOD較Model組有不同程度的降低(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 Model組CTGF染色較Sham組棕色區(qū)域增多，染色顯著加深;FH組較Model組顯著淡染，棕色區(qū)域散在;FL組棕色面積及顏色介于Model組和FH組之間。半定量分析顯示，與Sham組相比，Model組CTGF的MOD值升高(p＜0.01); FH組MOD與Sham組相近，較Model組顯著降低(p＜0.01);FL組較Model組降低(p＜0.05

14、)。
　　 5.各組大鼠心肌ACE蛋白水平比較Sham組ACE免疫染色較淺，棕色區(qū)域很少;Model組染色顯著加深，棕色區(qū)域顯著增多;FH組棕色區(qū)域較Model組顯著減少，整體顏色較Sham組稍深;FL組棕色面積及顏色介于Model組和FH組之間。半定量分析顯示，Model組心肌ACE蛋白水平較Sham組顯著升高(p＜0.01)，與Model組相比，F(xiàn)H組ACE蛋白水平將至正常水平，而FL組降低35％(p＜0.05)。
　

15、　 6.各組大鼠心肌ACE2蛋白水平比較200倍光鏡下，陽性細胞被染成棕黃色或褐色。Sham組可見散在的棕色區(qū)域，細胞輪廓清晰;與Sham組相比，Model組棕色區(qū)域更加少見，切片淡染;與Model組相比，F(xiàn)H組棕色區(qū)域明顯增多，可見成片的陽性細胞，切片染色較深，F(xiàn)L組較Model組棕色區(qū)域也顯著增多，但切片整體染色比FH組稍淺。半定量分析顯示，Model組ACE2蛋白水平較Sham組顯著降低(p＜0.01);與Model組比較，法舒

16、地爾可顯著升高心肌ACE2蛋白水平，F(xiàn)H組ACE2升高197％，F(xiàn)L組升高136％(p＜0.01)。
　　 7.各組大鼠心肌ACE2 mRNA表達水平的比較與Sham組相比，Model組大鼠心肌組織ACE2 mRNA表達顯著降低(p＜0.01);與Model組相比，法舒地爾顯著升高ACE2 mRNA的表達，F(xiàn)H組ACE2mRNA表達升高181％，而FL組ACE2 mRNA表達升高119％(p＜0.01)。
　　 8.各組

17、大鼠心肌和血漿AngⅡ、Ang(1-7)的濃度比較大鼠心肌組織中，Model組AngⅡ升高，Ang(1-7)顯著降低(p＜0.01)，AngⅡ/Ang(1-7)比值顯著升高;FH組AngⅡ水平與Sham組相似，Ang(1-7)水平較Model組升高213％(p＜0.01)，AngⅡ/Ang(1-7)被逆轉而＜1;與Model組相比，F(xiàn)L組AngⅡ水平降低35％(p＜0.05)，Ang(1-7)水平升高76％(p＜0.01)，AngⅡ/A

18、ng(1-7)降低至sham組水平。
　　 與Sham組相比，Model組血漿AngⅡ顯著升高(p＜0.01)，但是血漿Ang(1-7)改變無統(tǒng)計學意義，AngⅡ/Ang(1-7)比值顯著升高;與Model組相比，F(xiàn)H組血漿AngⅡ水平降低了49％，Ang(1-7)升高了106％(p＜0.01)，血漿AngⅡ/Ang(1-7)顯著降低;與Model組相比，F(xiàn)L組AngⅡ水平降低了33％，Ang(1-7)升高了43％(p＜0.01

19、)，血漿AngⅡ/Ang(1-7)降至Sham組水平。
　　 結論:
　　 1.腹主動脈縮窄誘導的壓力超負荷可誘導明顯的心肌纖維化，伴有心肌ACE、AngⅡ升高和ACE2、Ang(1-7)的降低。
　　 2.Rho激酶參與壓力超負荷誘導的心肌纖維化進程，其活性與AngⅡ、TGF-β1和CTGF水平相一致。
　　 3.法舒地爾抑制Rho激酶活性后，可明顯改善腹主動脈縮窄誘導的心肌纖維化，降低心肌ACE、An