ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸通過(guò)下調(diào)SOCE的活性抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　1.探討ACE2蛋白表達(dá)水平和乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)一步明確ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)和乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響。
　　2.探討乳腺癌細(xì)胞中，SOCE對(duì)E-cadherin表達(dá)變化調(diào)節(jié)的作用和機(jī)制。
　　3.明確ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對(duì)乳腺癌細(xì)胞SOCE的影響。
　　方法：
　　1.選取3個(gè)高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系(BT549、ZR-75-

2、30和MDA-MB-231)及3個(gè)低轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系（BT474、T-470和MCF-7），western blot不同細(xì)胞系的檢測(cè)ACE2蛋白水平。在低表達(dá)ACE2蛋白的MDA-MB-231細(xì)胞中，慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)ACE2蛋白;在高表達(dá)ACE2的MCF-7細(xì)胞系中，用shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲低ACE2蛋白或者M(jìn)as受體抑制劑A-779處理細(xì)胞。在構(gòu)建好的穩(wěn)定細(xì)胞系中，用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力的變化、transwell檢測(cè)其侵襲能力的

3、變化，明確ACE2蛋白和乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　2.用Ang-(1-7)處理MDA-MB-231細(xì)胞，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力的變化、transwell檢測(cè)其侵襲能力的變化，明確Ang-(1-7)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。并用Mas受體抑制劑A-779預(yù)處理細(xì)胞，觀察是否可以阻斷Ang-(1-7)的作用。
　　3.提取過(guò)表達(dá)或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌細(xì)胞或Ang-(1-7)處理的乳腺癌細(xì)胞系蛋白，檢測(cè)E-

4、cadherin蛋白和轉(zhuǎn)錄因子(ZEB1、TWIST1和Snail1)蛋白表達(dá)的變化。進(jìn)一步檢測(cè)核蛋白中NF-κB及Snail1、胞漿蛋白中PAK1磷酸化的水平;免疫熒光檢測(cè)NF-κB及Snail1核轉(zhuǎn)位。
　　4.用綠色熒光染料Fluo-4/AM染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，鈣內(nèi)流影像圖用FV10-ASW1.7 viewer軟件在激光共聚焦顯微鏡下記錄，觀察和比較高轉(zhuǎn)移能力的MDA-MB-231細(xì)胞和低轉(zhuǎn)移能力的MCF-7細(xì)胞中SOCE介導(dǎo)

5、的外鈣內(nèi)流水平。免疫熒光雙染Stim1和Orai1、Co-IP檢測(cè)Stim1和Orai1復(fù)合物的水平，評(píng)價(jià)MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7中細(xì)胞Stim1和Orai1相互作用的情況。
　　5.用SOCE抑制劑2-APB、SKF96365和鈣離子螯合劑EGTA處理MDA-MB-231細(xì)胞，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移變化及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察侵襲的變化;Fluo-4/AM染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，confocal檢測(cè)細(xì)胞SOCE;免疫熒光

6、雙染Stim1和Orai1、Co-IP檢測(cè)上述處理的乳腺癌細(xì)胞系中Stim1和Orai1復(fù)合物的變化;western blot檢測(cè)E-cadherin和轉(zhuǎn)錄因子(Snail1)蛋白表達(dá)、核蛋白中NF-κB及Snail1、胞漿蛋白中PAK1磷酸化的水平;免疫熒光檢測(cè)NF-κB及Snail1核轉(zhuǎn)位。
　　6.用綠色熒光染料Fluo-4/AM染色細(xì)胞內(nèi)鈣離子，鈣內(nèi)流影像圖用FV10-ASW1.7 viewer軟件在激光共聚焦顯微鏡下記錄

7、，觀察過(guò)表達(dá)或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌細(xì)胞系或者Ang-(1-7)處理的乳腺癌細(xì)胞系SOCE的變化。免疫熒光雙染Stim1和Orai1、Co-IP檢測(cè)上述處理的乳腺癌細(xì)胞系中Stim1和Orai1復(fù)合物的變化。
　　7.收集乳腺癌病人臨床資料，包括年齡、腫瘤分期、臨床分期等，和手術(shù)標(biāo)本切片，包括原位癌癌旁組織、原位癌組織、發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌組織、轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的癌組織。免疫組化檢測(cè)ACE2蛋白水平，并分析ACE2蛋白水平和臨床分期的關(guān)系

8、。
　　8.裸鼠實(shí)驗(yàn):6-8周齡裸鼠隨機(jī)分為四組，鼠尾靜脈注射1×106個(gè)細(xì)胞過(guò)表達(dá)或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌細(xì)胞系，6周后獲取肺組織行包埋、切片、HE染色，觀察肺組織轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量。
　　9.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于計(jì)量數(shù)據(jù)資料用Shapiro-Wilk法進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單

9、因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料率之間比較采用卡方檢驗(yàn)，臨床患者資料與及癌組織手術(shù)標(biāo)本切片ACE2表達(dá)水平之間關(guān)系分析采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系A(chǔ)CE2蛋白表達(dá)水平
　　在高遷移和侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞系BT549、ZR-75-30、MDA-MB-231中ACE2蛋白表達(dá)顯著低于遷移和侵襲能力較低的

10、乳腺癌細(xì)胞系BT474、T-470、MCF-7，兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ACE2的MDA-MB-231細(xì)胞及穩(wěn)定敲低ACE2蛋白的MCF-7細(xì)胞
　　慢病毒轉(zhuǎn)染后，MDA-MB-231細(xì)胞ACE2蛋白表達(dá)較lenti-NC組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染shNC質(zhì)粒及shACE2質(zhì)粒后，四個(gè)shACE2都能抑制MCF-7細(xì)胞ACE2蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;但以shACE2#2的效果最為明顯，以下實(shí)驗(yàn)均以轉(zhuǎn)染shACE2#2的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　3.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用
　　過(guò)表達(dá)ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增強(qiáng)MCF-7細(xì)

12、胞的遷移和侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對(duì)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、TWIST1和Snail1表達(dá)水平的影響
　　過(guò)表達(dá)ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細(xì)胞中ZEB1、 TWIST1和Snail1蛋白水平，敲低ACE2蛋白增加MCF-7細(xì)胞ZEB1、TWIST1和Snail1蛋白水平。但是以Snail1蛋白水平改變最為明顯。
　　5.AC

13、E2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對(duì)NF-κB/PAK1/Snail1通路的影響
　　過(guò)表達(dá)ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細(xì)胞中抑制核蛋白NF-κB及Snail1的水平、減少PAK1磷酸化及Snail1蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá);A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增加MCF-7細(xì)胞核蛋白中NF-κB及Snail1的水平、增加PAK1磷

14、酸化及Snail1蛋白表達(dá)，下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)。
　　6.SOCE對(duì)NF-κB/PAK1/Snail1通路的影響
　　MDA-MB-231細(xì)胞SOCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流較MCF-7細(xì)胞高。MDA-MB-231細(xì)胞中NF-κB及Snail1核轉(zhuǎn)位、PAK1磷酸化、Snail1蛋白表達(dá)水平較較MCF-7細(xì)胞高。SOCE抑制劑2-APB、SKF96365可抑制TG誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流，減少Stim1和Orai1復(fù)合物形成，鈣離子螯

15、合劑EGTA可細(xì)胞內(nèi)鈣的水平;2-APB、SKF96365和EGTA可以下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中NF-κB及Snail1核轉(zhuǎn)位、PAK1磷酸化、Snail1蛋白表達(dá)水平，增加E-cadherin蛋白表達(dá)。
　　7.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對(duì)SOCE的影響
　　過(guò)表達(dá)ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細(xì)胞的SOCE介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流，抑制Stim1和Orai1復(fù)合物形成;A-779可以

16、抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的SOCE介導(dǎo)的鈣內(nèi)流;增加Stim1和Orai1復(fù)合物形成。
　　8.不同臨床分期的乳腺癌手術(shù)標(biāo)本中ACE2蛋白
　　原位癌癌旁組織中ACE2蛋白表達(dá)水平較原位癌高，發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織及轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)中的癌組織中ACE2蛋白表達(dá)低于原位癌組織ACE2蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　9.裸鼠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACE2蛋白對(duì)

17、乳腺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響
　　鼠尾靜脈注射過(guò)表達(dá)ACE2的MDA-MB-231細(xì)胞的裸鼠，其肺組織中癌結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于較對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);鼠尾靜脈注射敲低ACE2蛋白的MCF-7細(xì)胞，其肺組織中的癌結(jié)節(jié)明顯多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸可抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移，其機(jī)制是通過(guò)抑制NF-κB/PAK1/Snail1通路活性，減少Sn