ACE2-Ang-(1-7)-Mas受體軸通過下調SOCE的活性抑制乳腺癌轉移.pdf

1、目的：
　　1.探討ACE2蛋白表達水平和乳腺癌轉移的關系，進一步明確ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對E-cadherin蛋白表達和乳腺癌轉移的影響。
　　2.探討乳腺癌細胞中，SOCE對E-cadherin表達變化調節(jié)的作用和機制。
　　3.明確ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對乳腺癌細胞SOCE的影響。
　　方法：
　　1.選取3個高轉移能力的乳腺癌細胞系(BT549、ZR-75-

2、30和MDA-MB-231)及3個低轉移能力的乳腺癌細胞系（BT474、T-470和MCF-7），western blot不同細胞系的檢測ACE2蛋白水平。在低表達ACE2蛋白的MDA-MB-231細胞中，慢病毒轉染過表達ACE2蛋白;在高表達ACE2的MCF-7細胞系中，用shRNA質粒轉染敲低ACE2蛋白或者Mas受體抑制劑A-779處理細胞。在構建好的穩(wěn)定細胞系中，用劃痕實驗檢測其遷移能力的變化、transwell檢測其侵襲能力的

3、變化，明確ACE2蛋白和乳腺癌細胞轉移的關系。
　　2.用Ang-(1-7)處理MDA-MB-231細胞，劃痕實驗檢測其遷移能力的變化、transwell檢測其侵襲能力的變化，明確Ang-(1-7)對MDA-MB-231細胞轉移能力的影響。并用Mas受體抑制劑A-779預處理細胞，觀察是否可以阻斷Ang-(1-7)的作用。
　　3.提取過表達或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌細胞或Ang-(1-7)處理的乳腺癌細胞系蛋白，檢測E-

4、cadherin蛋白和轉錄因子(ZEB1、TWIST1和Snail1)蛋白表達的變化。進一步檢測核蛋白中NF-κB及Snail1、胞漿蛋白中PAK1磷酸化的水平;免疫熒光檢測NF-κB及Snail1核轉位。
　　4.用綠色熒光染料Fluo-4/AM染色細胞內鈣離子，鈣內流影像圖用FV10-ASW1.7 viewer軟件在激光共聚焦顯微鏡下記錄，觀察和比較高轉移能力的MDA-MB-231細胞和低轉移能力的MCF-7細胞中SOCE介導

5、的外鈣內流水平。免疫熒光雙染Stim1和Orai1、Co-IP檢測Stim1和Orai1復合物的水平，評價MDA-MB-231細胞和MCF-7中細胞Stim1和Orai1相互作用的情況。
　　5.用SOCE抑制劑2-APB、SKF96365和鈣離子螯合劑EGTA處理MDA-MB-231細胞，劃痕實驗觀察細胞遷移變化及Transwell實驗觀察侵襲的變化;Fluo-4/AM染色細胞內鈣離子，confocal檢測細胞SOCE;免疫熒光

6、雙染Stim1和Orai1、Co-IP檢測上述處理的乳腺癌細胞系中Stim1和Orai1復合物的變化;western blot檢測E-cadherin和轉錄因子(Snail1)蛋白表達、核蛋白中NF-κB及Snail1、胞漿蛋白中PAK1磷酸化的水平;免疫熒光檢測NF-κB及Snail1核轉位。
　　6.用綠色熒光染料Fluo-4/AM染色細胞內鈣離子，鈣內流影像圖用FV10-ASW1.7 viewer軟件在激光共聚焦顯微鏡下記錄

7、，觀察過表達或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌細胞系或者Ang-(1-7)處理的乳腺癌細胞系SOCE的變化。免疫熒光雙染Stim1和Orai1、Co-IP檢測上述處理的乳腺癌細胞系中Stim1和Orai1復合物的變化。
　　7.收集乳腺癌病人臨床資料，包括年齡、腫瘤分期、臨床分期等，和手術標本切片，包括原位癌癌旁組織、原位癌組織、發(fā)生轉移的癌組織、轉移到淋巴結的癌組織。免疫組化檢測ACE2蛋白水平，并分析ACE2蛋白水平和臨床分期的關系

8、。
　　8.裸鼠實驗:6-8周齡裸鼠隨機分為四組，鼠尾靜脈注射1×106個細胞過表達或者敲低ACE2蛋白的乳腺癌細胞系，6周后獲取肺組織行包埋、切片、HE染色，觀察肺組織轉移結節(jié)的數(shù)量。
　　9.統(tǒng)計分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計分析。對于計量數(shù)據(jù)資料用Shapiro-Wilk法進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料使用均數(shù)±標準差描述。兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單

9、因素方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗。計數(shù)資料率之間比較采用卡方檢驗，臨床患者資料與及癌組織手術標本切片ACE2表達水平之間關系分析采用Fisher確切概率法。所有統(tǒng)計分析均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.不同轉移能力的乳腺癌細胞系ACE2蛋白表達水平
　　在高遷移和侵襲能力的乳腺癌細胞系BT549、ZR-75-30、MDA-MB-231中ACE2蛋白表達顯著低于遷移和侵襲能力較低的

10、乳腺癌細胞系BT474、T-470、MCF-7，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.構建穩(wěn)定過表達ACE2的MDA-MB-231細胞及穩(wěn)定敲低ACE2蛋白的MCF-7細胞
　　慢病毒轉染后，MDA-MB-231細胞ACE2蛋白表達較lenti-NC組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MCF-7細胞轉染shNC質粒及shACE2質粒后，四個shACE2都能抑制MCF-7細胞ACE2蛋白表達，差異有統(tǒng)

11、計學意義（P＜0.05）;但以shACE2#2的效果最為明顯，以下實驗均以轉染shACE2#2的MCF-7細胞進行實驗。
　　3.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對乳腺癌細胞遷移和侵襲的作用
　　過表達ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增強MCF-7細

12、胞的遷移和侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對轉錄因子ZEB1、TWIST1和Snail1表達水平的影響
　　過表達ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細胞中ZEB1、 TWIST1和Snail1蛋白水平，敲低ACE2蛋白增加MCF-7細胞ZEB1、TWIST1和Snail1蛋白水平。但是以Snail1蛋白水平改變最為明顯。
　　5.AC

13、E2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對NF-κB/PAK1/Snail1通路的影響
　　過表達ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細胞中抑制核蛋白NF-κB及Snail1的水平、減少PAK1磷酸化及Snail1蛋白表達，上調E-cadherin蛋白表達;A-779可以抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增加MCF-7細胞核蛋白中NF-κB及Snail1的水平、增加PAK1磷

14、酸化及Snail1蛋白表達，下調E-cadherin蛋白表達。
　　6.SOCE對NF-κB/PAK1/Snail1通路的影響
　　MDA-MB-231細胞SOCE介導的鈣內流較MCF-7細胞高。MDA-MB-231細胞中NF-κB及Snail1核轉位、PAK1磷酸化、Snail1蛋白表達水平較較MCF-7細胞高。SOCE抑制劑2-APB、SKF96365可抑制TG誘導的鈣內流，減少Stim1和Orai1復合物形成，鈣離子螯

15、合劑EGTA可細胞內鈣的水平;2-APB、SKF96365和EGTA可以下調MDA-MB-231細胞中NF-κB及Snail1核轉位、PAK1磷酸化、Snail1蛋白表達水平，增加E-cadherin蛋白表達。
　　7.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸對SOCE的影響
　　過表達ACE2蛋白或Ang-(1-7)抑制MDA-MB-231細胞的SOCE介導的外鈣內流，抑制Stim1和Orai1復合物形成;A-779可以

16、抑制ACE2和Ang-(1-7)的作用。敲低ACE2蛋白或者A-779可增強MCF-7細胞的SOCE介導的鈣內流;增加Stim1和Orai1復合物形成。
　　8.不同臨床分期的乳腺癌手術標本中ACE2蛋白
　　原位癌癌旁組織中ACE2蛋白表達水平較原位癌高，發(fā)生轉移的乳腺癌組織及轉移到淋巴結中的癌組織中ACE2蛋白表達低于原位癌組織ACE2蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　9.裸鼠實驗檢測ACE2蛋白對

17、乳腺癌體內轉移的影響
　　鼠尾靜脈注射過表達ACE2的MDA-MB-231細胞的裸鼠，其肺組織中癌結節(jié)數(shù)量明顯少于較對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);鼠尾靜脈注射敲低ACE2蛋白的MCF-7細胞，其肺組織中的癌結節(jié)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.ACE2/Ang-(1-7)/Mas受體軸可抑制乳腺癌轉移，其機制是通過抑制NF-κB/PAK1/Snail1通路活性，減少Sn