海洋活性物質(zhì)——泥蚶多肽的研究與應(yīng)用.pdf

1、近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，“向海洋要藥”已成為沿海國(guó)家藥學(xué)研究的新方向，各國(guó)學(xué)者采用現(xiàn)代科學(xué)方法與技術(shù)從海洋生物中分離和鑒定出了多種具有抗腫瘤藥理作用的天然物質(zhì)，為研制開(kāi)發(fā)抗腫瘤新藥奠定了基礎(chǔ)，顯示出誘人的研究開(kāi)發(fā)前景，從海洋生物及其代謝產(chǎn)物中篩選和提取具有特異化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)成為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。泥蚶(Arca granosa Linnaeus)，俗稱(chēng)血蚶，在中國(guó)沿海各省都有分布。據(jù)《醫(yī)林纂要》注“蚶肉補(bǔ)心血、散瘀血、除煩醒酒、破

2、結(jié)消痰”的功能，泥蚶的有效成分及生理作用受到廣泛關(guān)注。本研究以泥蚶為原料，分離純化出一種活性多肽—泥蚶多肽，在初步觀察其抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)進(jìn)行了抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)其抗腫瘤作用的機(jī)理進(jìn)行了較全面、系統(tǒng)的探討，以期為該物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。 本研究通過(guò)水提取、大分子量蛋白質(zhì)熱變性去除、凝膠過(guò)濾柱層析工藝分離了一組多肽活性成分，蛋白含量為67.32±3.45mg/ml，分子量分布于1000—5000Da。通過(guò)體、內(nèi)外實(shí)

3、驗(yàn)，系統(tǒng)觀察了該物質(zhì)的抗腫瘤作用。以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了其對(duì)整體動(dòng)物免疫功能的影響。體外以人肺腺癌細(xì)胞株A549，體內(nèi)以荷Iewis肺癌的C57BL/6雌性小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、單細(xì)胞凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、免疫化學(xué)、RT-PCR及Western Blot方法和技術(shù)，系統(tǒng)探討了泥蚶多肽抗腫瘤作用的機(jī)理。最后，又系統(tǒng)研究了泥蚶多肽的毒理作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泥蚶多肽在O.125mg/ml-0.5mg/ml濃度范圍內(nèi)，可劑

4、量依賴(lài)性的降低三種腫瘤細(xì)胞(A549，NCI-H460和Kerr-3)DNA的合成和總蛋白的含量，抑制細(xì)胞的增值和克隆形成率，而對(duì)HepG-2，MCF-7和MGC-803腫瘤細(xì)胞株的抑制作用較小。靜脈注射給藥在50mg/kg-200mg/kg劑量條件下，泥蚶多肽能提高Iewis肺癌小鼠的延命率，改善小鼠的生存質(zhì)量。對(duì)小鼠S-180實(shí)體瘤、EAC腹水瘤具有治療作用，在10mg/kg-100mg/kg劑量條件下對(duì)小鼠S-180實(shí)體瘤、EAC

5、腹水瘤及肝癌實(shí)體瘤具有預(yù)防治療作用，且存在劑量依賴(lài)關(guān)系。同時(shí)泥蚶多肽對(duì)正常小鼠的非特異性免疫和特異性免疫也具有增強(qiáng)作用。泥蚶多肽在0.125mg/ml-0.5mg/ml濃度范圍內(nèi)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，損傷細(xì)胞DNA，將細(xì)胞周期阻滯于G<,2>/M期，其機(jī)理與該物質(zhì)損傷線(xiàn)粒體，降低線(xiàn)粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及顯著抑制PCNA表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3活性和降低C—fos和C-jun蛋白表達(dá)有關(guān)。泥蚶多肽在50mg

6、／kg、100mg／kg、200mg／kg劑量范圍內(nèi)，對(duì)荷Lewis肺癌小鼠的腫瘤具有抑制作用，其機(jī)理與該物質(zhì)降低bcl-2mRNA、P53和P16蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)，增高Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)，但并不影響腫瘤組織中fas mRNA和C-myc的表達(dá)。毒理學(xué)研究結(jié)果表明，泥蚶多肽對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)和麻醉犬心率、血壓、心電圖各間期及呼吸頻率和深度無(wú)明顯影響。小鼠靜脈注射的最大耐受量大于2g／kg，小鼠皮下注射的最大耐受量大于5g／kg。

7、長(zhǎng)期靜脈注射本物質(zhì)對(duì)Beagle犬體重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、心電圖、尿常規(guī)均無(wú)明顯影響，對(duì)24個(gè)臟器病理組織檢查均無(wú)明顯影響。Ames實(shí)驗(yàn)證明泥蚶多肽的Ames實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果；對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果提示，其對(duì)動(dòng)物體細(xì)胞沒(méi)有明顯的致突變作用；對(duì)小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞也沒(méi)有明顯的致突變作用。靜脈注射250mg／kg、100mg／kg、50mg／kg、10mg/Kg泥蚶多肽對(duì)孕鼠體重、胚胎形成、胎鼠