文蛤多肽的研究與應(yīng)用.pdf

1、癌癥是目前死亡率最高的疾病，是名副其實(shí)的“頭號(hào)殺手”。從天然生物中篩選出能與癌癥發(fā)生、發(fā)展、形成等過程中各調(diào)節(jié)靶點(diǎn)特異結(jié)合的活性成分，已成為尋找抗癌藥物的新熱點(diǎn)。目前各國學(xué)者采用現(xiàn)代科學(xué)方法與技術(shù)從海洋生物中分離和鑒定出了多種具有抗腫瘤活性的天然物質(zhì)，為研制開發(fā)抗腫瘤新藥奠定了基礎(chǔ)，顯示出誘人的研究開發(fā)前景，從海洋生物及其代謝產(chǎn)物中篩選和提取具有特異化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要來源。文蛤(Meretrixmeretri

2、x Linnaeus)作為一種深受人們喜愛的海洋軟體動(dòng)物，不僅具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，更是有著極高的藥用價(jià)值。古往今來，文蛤的藥用價(jià)值一直深受人們的重視，它具有清熱利濕、化痰、散結(jié)的功效，對腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，還具有降血糖，降血脂，抗衰老等多種生理功能。其有效成分及生理作用受到越來越廣泛的關(guān)注。 本研究采用破碎、硫酸銨沉淀、乙醇抽提、Sephadex G-25分子篩層析等方法從文蛤中提取得到四個(gè)峰的物質(zhì)，利用MTT法分別檢測各

3、峰體外對癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)第二峰的物質(zhì)能抑制癌細(xì)胞的生長，將此活性物質(zhì)命名為Mer2；發(fā)現(xiàn)第一個(gè)峰的物質(zhì)能抑制酪氨酸酶的活性，減少黑素的形成，命名Mer1。 將Mer2處理肝癌HePG2細(xì)胞、膽管癌QBC939、宮頸癌Hela細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、L，TEP-a-2，觀察研究Mer2對癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)并進(jìn)一步探索其抑制癌細(xì)胞生長的作用機(jī)理。結(jié)果表明，Mer2對五種細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，但對正常的人肝chan

4、g-liver細(xì)胞抑制作用很小。當(dāng)濃度大于10μg/mL時(shí)，作用時(shí)間為72 h時(shí)，對肝癌HePG2細(xì)胞和膽管癌QBC939的抑制率便超過了50％，其中對肝癌HePG2細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)一些。通過光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)等方法，研究了文蛤多肽對體外培養(yǎng)的肝癌HePG2細(xì)胞和膽管癌QBC939的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明：Mer2處理后的細(xì)胞外形變化明顯，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞的懸浮生長，細(xì)胞的集落化程度降低，細(xì)胞群體數(shù)量

5、顯著降低，出現(xiàn)了凋亡小體。細(xì)胞周期的檢測結(jié)果說明，經(jīng)Mer2處理的肝癌HePG2細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，但細(xì)胞周期未出現(xiàn)明顯阻滯現(xiàn)象。表明文蛤多肽對癌細(xì)胞的生長抑制作用與細(xì)胞凋亡有關(guān)。 進(jìn)一步研究文蛤抗癌多肽抑制癌細(xì)胞的分子機(jī)制，我們利用蛋白組學(xué)雙向電泳技術(shù)初步探討了在經(jīng)Mer2作用前后肝癌HePG2細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化，以期為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。通過圖譜分析找到89個(gè)差異蛋白，其中66個(gè)表達(dá)下調(diào)，23個(gè)表達(dá)上

6、調(diào)。對其中部分差異較明顯的點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，最終鑒定出9種差異蛋白。其中7個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，2個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)。肝癌細(xì)胞：HePG2表達(dá)的差異蛋白種類涵蓋了從細(xì)胞結(jié)構(gòu)到細(xì)胞生理調(diào)控的各個(gè)方面。對差異點(diǎn)進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，差異蛋白有鋅指蛋白(Zinc finger protein624)，膜聯(lián)蛋白(Annexin A2)，細(xì)胞骨架蛋白(keratin1，type II，cytoskeletal)，分子伴侶蛋白(TCP-1-beta)，線粒體核糖體蛋白

7、(mitochondrial ribosomal protein L27)，DNA修復(fù)蛋白，腫瘤抑抑制蛋白以及其他的蛋白等，并對部分差異點(diǎn)的功能進(jìn)行了初步探討。 采用動(dòng)力學(xué)研究方法，體外研究了Mer1對蘑菇酪氨酸酶(Tyrosinase)活力的影響。結(jié)果表明Mer1對酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用，抑制過程呈濃度的關(guān)系，抑制作用是一種可逆過程，為反競爭性抑制，使酶活力喪失50％的抑制劑濃度(IC50)為95μg/mL，抑制常數(shù)(KIS