文蛤多肽的研究與應用.pdf

1、癌癥是目前死亡率最高的疾病，是名副其實的“頭號殺手”。從天然生物中篩選出能與癌癥發(fā)生、發(fā)展、形成等過程中各調節(jié)靶點特異結合的活性成分，已成為尋找抗癌藥物的新熱點。目前各國學者采用現代科學方法與技術從海洋生物中分離和鑒定出了多種具有抗腫瘤活性的天然物質，為研制開發(fā)抗腫瘤新藥奠定了基礎，顯示出誘人的研究開發(fā)前景，從海洋生物及其代謝產物中篩選和提取具有特異化學結構的天然活性物質成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要來源。文蛤(Meretrixmeretri

2、x Linnaeus)作為一種深受人們喜愛的海洋軟體動物，不僅具有豐富的營養(yǎng)價值，更是有著極高的藥用價值。古往今來，文蛤的藥用價值一直深受人們的重視，它具有清熱利濕、化痰、散結的功效，對腫瘤細胞有明顯的抑制作用，還具有降血糖，降血脂，抗衰老等多種生理功能。其有效成分及生理作用受到越來越廣泛的關注。 本研究采用破碎、硫酸銨沉淀、乙醇抽提、Sephadex G-25分子篩層析等方法從文蛤中提取得到四個峰的物質，利用MTT法分別檢測各

3、峰體外對癌細胞的抑制效應，發(fā)現第二峰的物質能抑制癌細胞的生長，將此活性物質命名為Mer2；發(fā)現第一個峰的物質能抑制酪氨酸酶的活性，減少黑素的形成，命名Mer1。 將Mer2處理肝癌HePG2細胞、膽管癌QBC939、宮頸癌Hela細胞、肺腺癌細胞SPC-A-1、L，TEP-a-2，觀察研究Mer2對癌細胞的生物學效應并進一步探索其抑制癌細胞生長的作用機理。結果表明，Mer2對五種細胞均有不同程度的抑制作用，但對正常的人肝chan

4、g-liver細胞抑制作用很小。當濃度大于10μg/mL時，作用時間為72 h時，對肝癌HePG2細胞和膽管癌QBC939的抑制率便超過了50％，其中對肝癌HePG2細胞的抑制作用更強一些。通過光學顯微鏡和流式細胞技術等方法，研究了文蛤多肽對體外培養(yǎng)的肝癌HePG2細胞和膽管癌QBC939的細胞形態(tài)、細胞周期的影響。結果表明：Mer2處理后的細胞外形變化明顯，貼壁細胞數量減少，出現了單個細胞的懸浮生長，細胞的集落化程度降低，細胞群體數量

5、顯著降低，出現了凋亡小體。細胞周期的檢測結果說明，經Mer2處理的肝癌HePG2細胞周期發(fā)生明顯變化，出現明顯的凋亡峰，但細胞周期未出現明顯阻滯現象。表明文蛤多肽對癌細胞的生長抑制作用與細胞凋亡有關。 進一步研究文蛤抗癌多肽抑制癌細胞的分子機制，我們利用蛋白組學雙向電泳技術初步探討了在經Mer2作用前后肝癌HePG2細胞蛋白表達的變化，以期為后續(xù)的研究提供理論基礎。通過圖譜分析找到89個差異蛋白，其中66個表達下調，23個表達上

6、調。對其中部分差異較明顯的點進行了鑒定，最終鑒定出9種差異蛋白。其中7個蛋白表達下調，2個蛋白表達上調。肝癌細胞：HePG2表達的差異蛋白種類涵蓋了從細胞結構到細胞生理調控的各個方面。對差異點進行鑒定后發(fā)現，差異蛋白有鋅指蛋白(Zinc finger protein624)，膜聯蛋白(Annexin A2)，細胞骨架蛋白(keratin1，type II，cytoskeletal)，分子伴侶蛋白(TCP-1-beta)，線粒體核糖體蛋白

7、(mitochondrial ribosomal protein L27)，DNA修復蛋白，腫瘤抑抑制蛋白以及其他的蛋白等，并對部分差異點的功能進行了初步探討。 采用動力學研究方法，體外研究了Mer1對蘑菇酪氨酸酶(Tyrosinase)活力的影響。結果表明Mer1對酪氨酸酶有較強的抑制作用，抑制過程呈濃度的關系，抑制作用是一種可逆過程，為反競爭性抑制，使酶活力喪失50％的抑制劑濃度(IC50)為95μg/mL，抑制常數(KIS