C-肽對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞NF-κB-iNOS途徑調(diào)控的初探.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetesmellitus，DM)全身微血管病變的腎臟特征表現(xiàn)，也是DM病人導(dǎo)致慢性腎衰竭的最主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅰ型DM約20％-40％、Ⅱ型DM約10％-20％的患者發(fā)生腎臟病變。DN是Ⅰ型DM最主要死亡原因，在Ⅱ型DM中其嚴(yán)重性僅次于心血管并發(fā)癥。DN的早期表現(xiàn)為腎小球系膜增生，基膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化。系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞外

2、基質(zhì)的主要固有細(xì)胞，通過(guò)其自身代謝和功能改變直接影響DN進(jìn)程。目前DN發(fā)病內(nèi)在機(jī)理尚未闡明，但已公認(rèn)其發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)是氧化應(yīng)激。
　　本課題組前期研究結(jié)果顯示，在DM大鼠腎臟組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵酶-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，iNOS活性顯著增高，其合成的一氧化氮(nitric oxide，NO)大量增加，過(guò)量產(chǎn)生的NO與超

3、氧陰離子(superoxide，O2-)快速反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)。ONOO-及其衍生物的氧化能力較H2O2強(qiáng)約2000倍，可造成嚴(yán)重氧化應(yīng)激損傷。
　　已知核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是iNOS基因轉(zhuǎn)錄最主要的調(diào)控因子。NF-κB家族包括p50、p52、p65(Rel-A)、c-Rel和Rel-B五個(gè)成員。它們通常以同源或異源二聚體形

4、式存在，其中以p50-p65二聚體最為常見(jiàn)。一般情況下，p50-p65二聚體與NF-κB抑制蛋白(Inhibitory kappa B protein，IκB)以非活性狀態(tài)的三聚體形式存在于細(xì)胞漿中。作為一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，被激活的NF-κB與IκB解離后入核，結(jié)合順式作用元件，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。
　　C-肽是胰島素原分子中連接胰島素A鏈與B鏈的連接肽。人C-肽由31個(gè)氨基酸殘基組成，分子量3020D，等電點(diǎn)3.0，半衰期30mi

5、n，主要經(jīng)腎臟代謝。正常人血漿C-肽基礎(chǔ)水平約為0.4nmol/L。最初，C-肽被認(rèn)為是胰島素合成過(guò)程中的副產(chǎn)物，一種無(wú)生物活性的“生物垃圾”。隨后，C肽被發(fā)現(xiàn)在胰島素原分子中對(duì)胰島素原分子的折疊、二硫鍵的正確配對(duì)等分子結(jié)構(gòu)的形成起重要作用，但血液中游離C-肽的生理功能卻一直不清楚。近年臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)，C-肽防治DN療效獨(dú)特，接近生理濃度的C-肽可部分恢復(fù)受損的腎小球功能，抑制細(xì)胞外基質(zhì)增生，明顯改善腎小球超微結(jié)構(gòu)，逆轉(zhuǎn)其纖維

6、化。到目前為止，除C-肽外，尚無(wú)其它任何藥物或治療方法可有效逆轉(zhuǎn)DN。雖然C-肽有此功能，但作用機(jī)制未明，亟待研究。
　　鑒于C-肽能有效逆轉(zhuǎn)DN，而氧化應(yīng)激已被證明是DN發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵酶iNOS主要受到NF-κB調(diào)控，我們推測(cè)：C-肽通過(guò)調(diào)控NF-κB-iNOS途徑，達(dá)到逆轉(zhuǎn)DN的功效。
　　那么，正常(低糖，5mmool/L)和高糖(25mmol/L)狀態(tài)下培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，給予不同濃度的C-肽、

7、作用不同時(shí)間后，C-肽在細(xì)胞中的功能定位如何；不同C-肽濃度、不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞中iNOS的表達(dá)水平有何影響；高糖處理系膜細(xì)胞對(duì)其NF-κ3的核轉(zhuǎn)位有何影響；一定濃度C-肽作用系膜細(xì)胞后，NF-κB的核轉(zhuǎn)位有何變化，未見(jiàn)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1，應(yīng)用高糖模擬糖尿病高糖狀態(tài)，應(yīng)用不同濃度C-肽、作用不同時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以免疫熒光染色法觀察C-肽在HBZY-1細(xì)胞中的功能定位；以實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)iNOS

8、表達(dá)水平的變化，來(lái)測(cè)定C-肽的有效濃度和起效時(shí)間；用免疫熒光染色法，以NF-κBp65亞基為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)測(cè)定NF-κB的核轉(zhuǎn)位及檢測(cè)C-肽對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響，為深入研究C-肽調(diào)控NF-κB-iNOS途徑的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1細(xì)胞培養(yǎng)
　　購(gòu)買低糖(5mmol/L)DMEM、高糖(25mmol/L)DMEM和0.25％EDTA-胰蛋白酶消化液，用含10％胎牛血清的低糖DMEM，在37℃、5％C

9、O2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。
　　2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組
　　細(xì)胞分組定義：正常組：HBZY-1細(xì)胞正常培養(yǎng)(低糖DMEM)后，換成C-肽-低糖DMEM培養(yǎng)；防治組：HBZY-1細(xì)胞正常培養(yǎng)后，換成C-肽-高糖DMEM培養(yǎng)；治療組：HBZY-1細(xì)胞高糖DMEM培養(yǎng)24h后，換成C-肽-高糖DMEM培養(yǎng)。
　　2.1探討治療組HBZY-1細(xì)胞，同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度C-肽在細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　治療組細(xì)胞，C-肽-高糖

10、DMEM作用30min，根據(jù)C-肽濃度不同分為5組：2、3、4、5、6μmol/L。
　　2.2探討正常組、防治組和治療組HBZY-1細(xì)胞，同一濃度，不同時(shí)間點(diǎn)C-肽在細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　正常組、防治組和治療組細(xì)胞，均加入C-肽濃度5μmol/L的高糖DMEM。正常組和防治組作用時(shí)間為：0、5、10、20、40、60、80、100、120min。治療組作用時(shí)間分為：0、5、10、20、40、60min。
　　2.3探

11、討高糖對(duì)HBZY-1細(xì)胞中iNOS表達(dá)水平的影響。
　　用高糖DMEM培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞，根據(jù)高糖作用時(shí)間不同分為11組：正常對(duì)照、高糖0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h。
　　2.4探討C-肽對(duì)HBZY-1細(xì)胞中iNOS表達(dá)水平的影響。
　　C-肽-高糖DMEM作用防治組細(xì)胞4h，根據(jù)C-肽濃度不同分為8組：正常對(duì)照、C-肽-高糖0、500、50、5、1、0.5、0.1nmol/L。

12、>　　C-肽-高糖DMEM作用治療組細(xì)胞，根據(jù)0.5nmol/L C-肽作用細(xì)胞時(shí)間不同分為8組：正常對(duì)照、C-肽-高糖0、0.5、1、2、4、6、8h。
　　2.5探討高糖狀態(tài)下，HBZY-1細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位情況。
　　用高糖DMEM作用HBZY-1細(xì)胞，根據(jù)高糖作用時(shí)間不同分為9組：0、5、10、15、20、25、30、35、40min。
　　用高糖DMEM作用HBZY-1細(xì)胞，續(xù)40min之后，根據(jù)高糖作用

13、時(shí)間不同分為34組：45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210min。
　　2.6探討高糖狀態(tài)下，C-肽作用后，HBZY-1細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位情況。
　　根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為3組：正常對(duì)照、高糖對(duì)照和0.5nmol/L

14、C-肽-高糖DMEM，作用時(shí)間為35min。
　　3 C-肽功能定位、NF-κB核轉(zhuǎn)位及C-肽影響NF-κ3核轉(zhuǎn)位的形態(tài)學(xué)觀察。
　　免疫熒光染色法觀察HBZY-1細(xì)胞中C-肽的功能定位、NF-κB是否轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)、C-肽是否能影響NF-κ3的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：
　　1治療組HBZY-1細(xì)胞，同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度C-肽在細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　免疫熒光顯示，各組C-肽主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。C-肽在細(xì)胞中的熒

15、光強(qiáng)度隨C-肽濃度增大而增強(qiáng)，且C-肽濃度為5μmol/L時(shí)最為顯著。因此選5μmol/L的C-肽為研究C-肽功能定位的最佳濃度。(見(jiàn)Fig.1)
　　2正常組、防治組和治療組HBZY-1細(xì)胞，同一濃度，不同時(shí)間點(diǎn)C-肽在細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　免疫熒光顯示，正常組細(xì)胞在120min內(nèi)均未檢測(cè)到C-肽熒光；(見(jiàn)Fig-2A)防治組細(xì)胞前60min亦未在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到C-肽熒光，但80、100和120min均發(fā)現(xiàn)C-肽熒光積聚于核

16、；(見(jiàn)Fig.2B)治療組細(xì)胞5min時(shí)即在核內(nèi)觀測(cè)到C-肽熒光，且C-肽熒光強(qiáng)度隨C-肽加入時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，20min時(shí)最為顯著。(見(jiàn)Fig.2C)
　　3高糖對(duì)HBZY-1細(xì)胞中iNOS表達(dá)水平的影響。
　　Real-time PCR結(jié)果顯示：細(xì)胞中iNOS的表達(dá)水平隨高糖處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高，以4h(0.5927±0.04709)最為顯著。(見(jiàn)Fig.3，Table1)
　　4 C-肽對(duì)HBZY-1細(xì)胞中iNOS表

17、達(dá)水平的影響。
　　Real-time PCR結(jié)果顯示：6種不同濃度C-肽均可抑制防治組細(xì)胞iNOS的表達(dá)水平，但該抑制作用不隨C-肽濃度增大而增強(qiáng)，C-肽濃度為0.5nmol/L時(shí)最為顯著(0.0437±0.00496)。(見(jiàn)Fig.4A，Table2)
　　隨0.5nmol/L濃度C-肽作用于治療組細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中iNOS的表達(dá)水平被抑制，6h(0.0575±0.00507)最為顯著。(見(jiàn)Fig.4B，Table3

18、)
　　5高糖狀態(tài)下，HBZY-1細(xì)胞中NF-κB核轉(zhuǎn)位情況。
　　免疫熒光顯示，高糖培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞35min時(shí)，NF-κB核轉(zhuǎn)位最為顯著。(見(jiàn)Fig.5A)由45min到210min，每隔5min觀測(cè)一次，結(jié)果顯示：NF-κB核轉(zhuǎn)位具有周期振蕩現(xiàn)象，NF-κB從胞漿-胞核-胞漿進(jìn)出過(guò)程需約50min，且趨勢(shì)漸緩，隨高糖刺激時(shí)間增長(zhǎng)，NF-κB傾向于滯留核內(nèi)。(見(jiàn)Fig.5B)
　　6高糖狀態(tài)下，應(yīng)用C-肽后，H

19、BZY-1細(xì)胞中的NF-κB核轉(zhuǎn)位。
　　免疫熒光顯示，與高糖對(duì)照組相比，C-肽-高糖DMEM組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB核轉(zhuǎn)位顯著減少。(見(jiàn)Fig.6)
　　結(jié)論：
　　1實(shí)驗(yàn)證實(shí)5μmol/L C-肽是觀察其功能定位最佳濃度。
　　2本研究發(fā)現(xiàn)：不同糖濃度、時(shí)間處理的系膜細(xì)胞，對(duì)C-肽的通透狀態(tài)決然不同：C-肽可快速(5min)進(jìn)入治療組細(xì)胞中，且主要在核內(nèi)聚集，C-肽熒光強(qiáng)度隨其加入時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，20min時(shí)最為

20、顯著；防治組細(xì)胞在80min后，始見(jiàn)C-肽進(jìn)入細(xì)胞核；C-肽不進(jìn)入正常組細(xì)胞。但其機(jī)制不明，值得探討。
　　3 C-肽可明顯抑制高糖引起的系膜細(xì)胞iNOS高表達(dá)，其抑制強(qiáng)度以0.5nmol/L C-肽濃度最為顯著，且該抑制作用不隨C-肽濃度增大而增強(qiáng)。
　　4實(shí)驗(yàn)觀察到：高糖刺激系膜細(xì)胞，NF-κB核轉(zhuǎn)位以35min時(shí)最為顯著。在45min到210min期間觀測(cè)到：NF-κB核轉(zhuǎn)位具有周期振蕩現(xiàn)象，即NF-κB從胞漿-胞核-