采用隨機(jī)PCR方法對(duì)臨床標(biāo)本中未知RNA病毒鑒定的研究.pdf

1、目的：
　　 分別以臨床糞便標(biāo)本中已知腸道病毒和含漱液標(biāo)本中已知呼吸道病毒為假設(shè)未知RNA病毒，在隨機(jī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)標(biāo)本前處理方法的改進(jìn)，探索一種不依賴于病毒培養(yǎng)，直接對(duì)臨床標(biāo)本中未知RNA病毒作出鑒定的分子生物學(xué)方法。
　　 方法：
　　 1、臨床標(biāo)本的前處理：首先對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行前處理，包括反復(fù)凍融、低溫離心、微孔膜過濾、聚乙二醇濃縮，以及核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的處理。通過對(duì)臨床標(biāo)本前處理方法的

2、改進(jìn)與優(yōu)化，盡可能地去除標(biāo)本中的無關(guān)核酸，以增大病毒核酸在標(biāo)本中所占的比例，提高陽性檢出率。
　　 (1)將臨床糞便和含漱液標(biāo)本反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心10min，使包裹于細(xì)胞中的病毒充分釋放，以提高標(biāo)本中病毒含量。
　　 (2)經(jīng)0.22μm濾膜過濾，去除細(xì)胞碎片、雜質(zhì)和細(xì)菌等顆粒物質(zhì)。
　　 (3)在濾液中加入10％的聚乙二醇6000，用以濃縮病毒液。37℃孵育1h后，于4℃過夜。次日12000

3、r/min4℃離心30min，沉淀用200μl焦碳酸二乙酯水懸浮。
　　 (4)在200μl懸浮液中加入15μ,1200μg/ml的核糖核酸酶A，37℃溫浴2h，以除去標(biāo)本液中游離的RNA。
　　 (5)核糖核酸酶處理之后立即提取病毒RNA,在RNA提取液中加入脫氧核糖核酸酶，37℃溫浴30min，以去除RNA中的DNA污染物。
　　 2、病毒RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄與隨機(jī)PCR擴(kuò)增：對(duì)經(jīng)前處理后的臨床標(biāo)本提取病毒R

4、NA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以錨定隨機(jī)引物合成第一鏈互補(bǔ)cDNA，在KlenowDNA聚合酶的作用下，合成雙鏈cDNA。用cDNA作模板，以錨定特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　 3、擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化與克?。焊鶕?jù)Marker的位置切取300～1500bp區(qū)域的凝膠條，回收純化PCR產(chǎn)物，將純化的目的片段與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)藍(lán)白斑篩選原理，隨機(jī)挑取若干分離良好的白斑，增菌培養(yǎng)。以菌液為模

5、板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證載體中有無插入片段。
　　 4、測(cè)序及比對(duì)：將獲得的陽性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定。獲得的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST在線比對(duì)，根據(jù)同源性確定核酸片段的來源，并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知病毒的鑒定。
　　 5、不明病原的臨床標(biāo)本驗(yàn)證：采用本研究所建立的方法對(duì)6份具有疑似流感癥狀但流感病毒檢測(cè)呈陰性的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行未知病毒鑒定，用以對(duì)方法的實(shí)用性與臨床效果加以驗(yàn)證，同時(shí)也以期查明該時(shí)期除流感病毒外，引起患兒流感

6、樣癥狀的主要病原體。
　　 結(jié)果：
　　 1、糞便標(biāo)本陽性克隆的插入序列經(jīng)BLAST比對(duì)后結(jié)果：糞便標(biāo)本的所獲得8個(gè)克隆中有6個(gè)克隆與人腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒（簡(jiǎn)稱埃可病毒）14型同源性最高，達(dá)95％～99％；其余2個(gè)克隆與細(xì)菌同源性很高。本研究從病毒載量為1.0×106Cope/ml的糞便標(biāo)本中，以75％的病毒陽性克隆率的檢出了標(biāo)本中的腸道病毒。
　　 2、含漱液標(biāo)本陽性克隆的插入序列經(jīng)BLAST比對(duì)后結(jié)果：含

7、漱液標(biāo)本10個(gè)陽性克隆中，有7個(gè)與甲3亞型流感病毒(H3N2)同源性最高(99％～100％)，其余3個(gè)為細(xì)菌和人基因組DNA。本研究通過對(duì)標(biāo)本前處理方法的改進(jìn)，從病毒載量為4.8×103Cope/ml的含漱液標(biāo)本中，以70％的病毒陽性克隆率檢測(cè)出標(biāo)本中的甲3亞型流感病毒病毒。
　　 3、臨床標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果：對(duì)6份具有疑似流感癥狀但流感病毒檢測(cè)呈陰性的咽拭子標(biāo)本檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，除1份標(biāo)本無陽性結(jié)果外，其他5份中有1份標(biāo)本病毒陽性克隆的插

8、入序列與基因庫公布的人腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒9型同源性最高(96％～99％)；另外4份標(biāo)本病毒陽性克隆的插入序列與柯薩奇病毒A組4型同源性最高(97％～100％)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功建立了一種基于隨機(jī)PCR的未知RNA病毒的檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)在于不依賴病毒的細(xì)胞培養(yǎng)及其核酸序列信息，并且能極大地提高對(duì)RNA病毒鑒定的陽性率，這種方法的建立為檢測(cè)不明原因疾病和新發(fā)傳染病病原體提供了新的思路，這將在不明原因疾病和