家蠶核型多角體病毒中RNA干擾抑制子的篩選與鑒定研究.pdf

1、RNAi是由dsRNA觸發(fā)的高度保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，在植物和昆蟲中，RNAi是一種主要的抗病毒防御機(jī)制。病毒進(jìn)入宿主后，其復(fù)制過(guò)程中形成的dsRNA在宿主 RNA酶Ⅲ Dicer2的作用下，被切割成21-23nt的siRNA，siRNA隨后被組裝到RISC中，引導(dǎo)AGO2切割與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA，從而阻斷病毒的復(fù)制。然而許多植物和動(dòng)物病毒也進(jìn)化出了RNAi的抑制子----VSR，來(lái)抑制宿主的抗病毒途徑。這些VSR都是在病毒感染宿主

2、過(guò)程中起到重要作用的蛋白，但它們?cè)诨蛐蛄泻筒《窘Y(jié)構(gòu)上并不保守，而且在RNAi機(jī)制中的作用位點(diǎn)也不相同。比如，F(xiàn)HV B2蛋白和DCV的1A蛋白可以與dsRNA結(jié)合，阻止dsRNA被識(shí)別及剪切成siRNA。FHVB2蛋白也可以與siRNA結(jié)合，阻止RISC的組裝。而CrPV的1A蛋白、TCV的P38蛋白、poleorviruses的P0蛋白等通過(guò)與AGO2蛋白相互作用，阻止RISC的組裝或作用于RNAi的效應(yīng)階段。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，與A

3、GO蛋白作用的一部分RNA干擾抑制子，通過(guò)保守的GW/WG motif與AGO蛋白結(jié)合，從而抑制RNAi應(yīng)答。研究稱，AGO蛋白中發(fā)揮與GW/WG motif結(jié)合功能是PIWI結(jié)構(gòu)域。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴體外合成兩條針對(duì)螢火蟲熒光素酶的雙鏈RNA----dsFluc1和 dsFluc2，將其與雙熒光素酶報(bào)告基因共同轉(zhuǎn)染BmN4-SID1細(xì)胞，對(duì)酶活的測(cè)定結(jié)果顯示，兩條dsRNA均抑制螢火蟲熒光素酶的表達(dá)，即其均觸發(fā) RNA

4、i機(jī)制。而dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi效應(yīng)強(qiáng)于dsFluc1，因此選擇dsFluc2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在未感染的BmN4-SID1細(xì)胞中，dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi對(duì)螢火蟲熒光素酶的沉默為dsRed的5倍，而在BV病毒感染的細(xì)胞中，這種基因沉默的現(xiàn)象基本得到回復(fù)，顯示BmNPV可以抑制家蠶BmN4-SID1細(xì)胞中的RNAi過(guò)程。⑵用Blastx的方法在TCV、SPMMV和ToRSV的總蛋白中篩選含GW/WG motif的蛋白，分別得到

5、2個(gè)、5個(gè)和5個(gè)含GW/WG motif的蛋白，發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的這三個(gè)病毒的VSR-P38、P1和CP蛋白分別位于其中，證明可以用這種方法找出病毒中含GW/WG motif的抑制子。對(duì)BmNPV中含GW/WG motif的蛋白進(jìn)行篩選，共得到16個(gè)蛋白，按照功能不同將其分為四類：結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制和表達(dá)相關(guān)蛋白、宿主機(jī)體調(diào)節(jié)蛋白及其他功能蛋白。這些蛋白在病毒DNA的復(fù)制、完整病毒粒子的組裝、病毒進(jìn)入宿主以及子代病毒的釋放等過(guò)程中分別顯示出重要功

6、能。包膜蛋白GP64/67、ODV-E66和衣殼蛋白o(hù)rf1629，38K和VP39是構(gòu)成病毒粒子的主要蛋白，并在蛋白進(jìn)入宿主和出芽過(guò)程中起重要作用。P47，DNA Polymerase和DNA Helicase作用于病毒DNA的復(fù)制，影響病毒增殖。Cystein Protease，Chitinase和 p35調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞狀態(tài)，病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制及組裝完成后，需要借助于前兩者對(duì)宿主機(jī)體的降解和液化來(lái)把釋放子代病毒，而受感染的細(xì)胞為保護(hù)同

7、伴，會(huì)啟動(dòng)“自殺”程序——細(xì)胞凋亡來(lái)阻止病毒大量擴(kuò)增，p35則作用于抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程，幫助病毒為所欲為地在宿主體內(nèi)擴(kuò)增，并且研究發(fā)現(xiàn)p35在AcMNPV中的同源基因是RNAi的抑制子。P33、orf4和P48作用于BV增殖、ODV組裝及成熟子代病毒產(chǎn)生，PIF1介導(dǎo)ODV進(jìn)入宿主細(xì)胞膜，P43功能未知。另外，用VSR預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì) BmNPV的總蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出5個(gè)預(yù)測(cè)值最高的蛋白，分別是DNA Polymerase，ODV-E66，以

8、及作用于病毒基因的復(fù)制和表達(dá)過(guò)程的 IE-1和LEF-3，包膜蛋白o(hù)rf14。⑶對(duì)預(yù)測(cè)的14個(gè)基因進(jìn)行克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建，分別是BmNPV-p35、LEF-3、IE1、GP64、Chitinase、Cystein protease、PIF1、orf1629、P47、P43、P48、orf4和VP39。對(duì)基因進(jìn)行T克隆，測(cè)序驗(yàn)證正確后構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確顯示過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功，得到pSLfa1180[Hr3-A4-Gen

9、e-SV40]。orf14通過(guò)Gateway方法構(gòu)建到pie2FW載體中。向家蠶細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體，定量PCR檢測(cè)顯示目標(biāo)基因均能在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。初步選擇9個(gè)候選基因進(jìn)行鑒定，分別是IE1、orf4、P48、p35、LEF-3、orf1629、P47、VP39和P43。同樣借助BmE細(xì)胞中dsFluc2干涉對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因中螢火蟲熒光素酶基因的沉默現(xiàn)象，向細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體，Western Blot檢測(cè)顯示9個(gè)基因均在家蠶