采用改良的AP-PCR技術(shù)對(duì)胃癌相關(guān)基因片段的分離與鑒定.pdf

1、同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文采用改良的AP-PCR技術(shù)對(duì)胃癌相關(guān)基因片段的分離與鑒定姓名：胡蓉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：內(nèi)科學(xué)(消化系病)指導(dǎo)教師：王家(馬龍)2000.5.1旦墮墾登查蘭墮主蘭垡壘莖、。，，一檢索，同源性低的序列遞交O e n e B a n k j 第三部分是差異片段的克隆及l(fā) 臨床檢測(cè)。錳G e n e B a n k 同源性檢索確定為新序列后，將P C R 產(chǎn)物克隆在P O E M ．T 載體上，提取質(zhì)粒備用；根據(jù)測(cè)序

2、結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用P C R 方法對(duì)收集的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。本研究應(yīng)用改進(jìn)的A P ．P C R 技術(shù)，從配對(duì)的胃癌組織和非癌胃組織D N A 中分離出僅存在于非癌組織的二條差異片段，斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明在非癌組織中的雜交信號(hào)明顯強(qiáng)于癌組織，對(duì)其中一條8 n c l f 進(jìn)行序列測(cè)定，將結(jié)果輸入G - e n e B a n k ，經(jīng)B L A S T 軟件分析無(wú)同源序列存在。該片段被O e n e B a n k 接受，接受號(hào)為A F

3、 2 2 2 9 2 5 。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)2 0 例配對(duì)的胃癌組織和非癌胃組織D N A 進(jìn)行檢測(cè)，胃癌組織中檢出率較低( 2 ／2 0 ) ，非癌組織中的檢出率較高( 1 1 ／2 0 ) 。本研究意義在于：1 分離出的8 n d f 在非癌組織中普遍存在而癌組織中缺如，且在O e n e B a n k 中無(wú)同源序列存在，可能為一新的候選抑癌基因，還需進(jìn)一步的篩查和功能研究。2 根據(jù)其序列設(shè)計(jì)的特異性引物．可能對(duì)

4、胃癌的診斷有一定的幫助。3 本研究對(duì)A P - P C R 方法進(jìn)行改良，建立了優(yōu)化的P C R 循環(huán)參數(shù)，提高了特異性。4 本研究對(duì)獲取的差示P C R 產(chǎn)物的后續(xù)處理進(jìn)行了改進(jìn)，先鑒定為非假陽(yáng)性產(chǎn)物后直接進(jìn)行測(cè)序及G - e n e B a n k 檢索，證實(shí)為非同源序列后才進(jìn)行克隆，這樣的流程設(shè)計(jì)更加合理，不僅提高了效率，而且確保了克隆片段為有意義的序列。避免了先克隆后測(cè)序的盲目性。夕一?！乓灰灰灰魂P(guān)鍵詢(xún)； 胃癌，D N A 指