人Cu，Zn-SOD在畢赤酵母中克隆表達(dá)的研究.pdf

1、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)在生物體內(nèi)起著非常重要的作用，它是一類廣泛存在于生物體的各個(gè)組織中的金屬酶。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母。 本文構(gòu)建表達(dá)人Cu,Zn-SOD的重組酵母工程菌株，在搖瓶水平探索不同外界條件對(duì)培養(yǎng)上清酶活性的影響，測(cè)試目的蛋白酶的穩(wěn)定性。根據(jù)酵母密碼子偏好性，化學(xué)合成人Cu,Zn-SOD基因，克隆至真核表達(dá)載體pPIC9K中

2、，將pPIC9K-SOD線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用G418篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE(12％)和Western blot檢測(cè)。用Lowry法測(cè)定蛋白含量，用改進(jìn)的鄰苯三酚法測(cè)定目的蛋白酶活性，測(cè)定不同外界條件下培養(yǎng)液上清中的酶活性，測(cè)試粗酶液對(duì)化學(xué)試劑，溫度和pH的穩(wěn)定性。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)目的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為18KD左右，

3、低糖基化，目的蛋白占外分泌蛋白總量的27％，Lowry法測(cè)定目的蛋白最高表達(dá)量為91mg/L?；钚詼y(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳條件下培養(yǎng)液上清的酶活性為334U/ml，粗酶對(duì)氯仿和乙醇穩(wěn)定，對(duì)H<,2>O<,2>/不穩(wěn)定，粗酶對(duì)溫度和pH都較穩(wěn)定。最佳發(fā)酵條件初步確定為初始pH6.0，維持甲醇濃度1.5％，持續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)。在畢赤酵母GS115細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了具備酶活性的人Cu,Zn-SOD。初步確定了發(fā)酵的的最佳條件和粗酶液對(duì)化學(xué)試劑，溫度