有關(guān)SAM合成酶的代謝與基因工程研究.pdf

1、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine ，簡稱SAM 或AdoMet)是生物體內(nèi)重要的中間代謝物質(zhì)，參與多種生化反應(yīng)，具有廣泛和多樣的治療作用。通過微生物的發(fā)酵進(jìn)而提取SAM 是目前SAM 的主要工業(yè)生產(chǎn)途徑。SAM 的生產(chǎn)一直以S.cerevisiae發(fā)酵為主。本實驗室通過合理改造Pichia pastoris 的代謝通路，獲得了一株組成型表達(dá)SAM 合成酶2(SAM2)的重組P.pastoris 菌株。為探

2、索用GAP 啟動子(PGAP)取代AOX1啟動子(PAOX1)，在畢節(jié)酵母(P.pastoris)中組成型表達(dá)外源蛋白的可能性，應(yīng)用PCR 方法從P.pastoris 染色體中擴(kuò)增了GAP 啟動子，以其取代誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPIC9K 上的PAOX1 ，構(gòu)建了組成型表達(dá)載體pGAP9K 。將腺苷甲硫氨酸合成酶Ⅱ(SAM)基因重組于pGAP9K 的多克隆位點，獲得含SAM 基因的重組質(zhì)粒pGAP9K-SAM 。轉(zhuǎn)化P.pastorisGS1

3、15 ，對獲得的高拷貝轉(zhuǎn)化子P.pastoris GS115(pGAP9K-SAM)進(jìn)行組成型表達(dá)，同時以誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)化子P.pastoris GS115(pPIC9K-SAM)作為對照。組成型轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)4d 后SAM2 的表達(dá)酶活已達(dá)到高峰；而誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)6d 后達(dá)到高峰，表達(dá)量也只是組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)高峰時(4d)的81﹪。以上結(jié)果表明，以GAP 啟動子構(gòu)建的組成型表達(dá)系統(tǒng)具有發(fā)酵時間較短、表達(dá)水平較高、不用甲醇誘導(dǎo)、操作系統(tǒng)比較簡