免疫性血小板減少癥患者外周血中負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-1及其配體的表達(dá).pdf

1、研究背景與目的：
　　免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia，ITP)是由機(jī)體免疫功能紊亂引起的以血小板破壞增加致數(shù)目減少為特征的自身免疫性出血性疾病，主要以自身血小板抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多為特征。近年的研究表明，ITP作為一種異質(zhì)性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制不僅包括體液免疫功能的紊亂，還包括細(xì)胞免疫功能的失調(diào)，其中T淋巴細(xì)胞起重要作用。T細(xì)胞的激活除需要組織相容性抗原(MHC，Major histo

2、compatibility antigens)-抗原肽復(fù)合物刺激（即第一信號(hào)）外，還需要共刺激信號(hào)（又稱第二信號(hào)）。若缺乏后者，則導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能，甚至發(fā)生程序性凋亡。程序性死亡因子1(PD-1，programmed death-1)及其配體PD-L1(programmed death ligand-1)是近年研究發(fā)現(xiàn)的重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子，介導(dǎo)負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)，被認(rèn)為與移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、慢病毒感染、腫瘤免疫逃逸等疾病密切相

3、關(guān)。
　　PD-1是一個(gè)免疫抑制性受體，其結(jié)構(gòu)和功能類似于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CILA-4，cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4)，可為T細(xì)胞活化提供抑制性信號(hào)。PD-1可通過(guò)抑制自身反應(yīng)性初始T細(xì)胞向T效應(yīng)細(xì)胞(Teff, effectorT cells)轉(zhuǎn)化;誘導(dǎo)Teff向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg，regulatory T cells)轉(zhuǎn)化;以及通過(guò)激活Treg或樹(shù)突狀細(xì)

4、胞(DCs，dendritic cells)抑制Teff等機(jī)制抑制T細(xì)胞免疫，在建立與/或維持外周自身免疫耐受中起到十分重要的作用。
　　PD-L1（又稱B7-H1）和PD-L2(又稱B7-DC)是PD-1的兩種配體。PD-1與其配體PD-L1/PD-L2的結(jié)合，可明顯抑制T細(xì)胞受體(TCR，T cell receptor)介導(dǎo)的T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使細(xì)胞停留在G0/G1期。PD-1/PD-L信號(hào)通路是在CTLA-4/B

5、7被發(fā)現(xiàn)之后的又一個(gè)重要的負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的刺激通路，其功能主要是削弱、限制T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的活化以及外周炎癥反應(yīng)。研究已經(jīng)證明，PD-1信號(hào)傳導(dǎo)通路的異?？蓪?dǎo)致外周免疫耐受的打破和自身免疫性疾病的發(fā)生，而ITP作為一種組織特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病是否與PD-1/PD-L通路相關(guān)目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究擬通過(guò)檢測(cè)ITP患者外周血T淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)上PD-1與PD-L1及PD-L2的表達(dá)及血漿中可溶性PD-1

6、(sPD-1)的水平，PBMCs中sPD-1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量，探討PD-1/PD-L通路在ITP發(fā)病中的意義及可能的機(jī)制。
　　研究對(duì)象與方法：
　　外周血46份標(biāo)本均來(lái)自于2014年11月至2015年4月住院患者的新發(fā)或復(fù)發(fā)的活動(dòng)性ITP患者，所有患者都符合ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，采樣前至少一周未接受過(guò)免疫抑制劑治療。前30份標(biāo)本，其中女22例，男8例，年齡14-76歲，中位年齡為39.1歲，血小板計(jì)數(shù)(0-27)×109/L，中

7、位血小板計(jì)數(shù)為8.7×109/L。這30份標(biāo)本用于流式細(xì)胞術(shù)(FCM，F(xiàn)low Cytometry)的檢測(cè)及酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)實(shí)驗(yàn)。另外16份標(biāo)本，其中女10例，男6例，年齡16-72歲，中位年齡為39.5歲，血小板計(jì)數(shù)(2-19)×109/L，中位血小板計(jì)數(shù)為10×109/L。這16份標(biāo)本用于逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT

8、-PCR)的檢測(cè)。正常對(duì)照來(lái)自于36名健康志愿者，女20例，男16例，年齡19-72歲，中位年齡38歲，血小板計(jì)數(shù)(129-241)×109/L，中位184×109/L。采用FCM檢測(cè)外周血CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞和DCs上PD-1與PD-L1及PD-L2的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血漿中可溶性PD-1(sPD-1)的水平，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription PCR，RT-PCR)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞表

9、面sPD-1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量。
　　研究結(jié)果：
　　1、T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)
　　CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的陽(yáng)性率明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01);CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的陽(yáng)性率也明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。
　　2、DCs表面PDL1和PDL2的表達(dá)
　　PDL1在ITP患者樹(shù)突狀細(xì)胞上的平均熒光強(qiáng)度明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.05);PDL2在ITP患者樹(shù)突狀細(xì)胞上的平均

10、熒光強(qiáng)度明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.01)。
　　3、血漿sPD-1濃度
　　ITP組中血漿sPD-1濃度明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。
　　4、外周血單個(gè)核細(xì)胞表面sPD-1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量
　　ITP組中外周血單個(gè)核細(xì)胞表面sPD-1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論：
　　結(jié)果顯示，異常表達(dá)的PD-1、PD-L1、PD-L2可能在ITP的發(fā)病過(guò)程中起到核心作用。