腎康丸對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用及對(duì)CD2AP、ZO-1表達(dá)的影響.pdf

1、眾所周知,糖尿病(Diabetic mellitus,DM)已成為21世紀(jì)世界范圍內(nèi)的一種流行病。它是繼腫瘤、血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性非傳染性疾病,具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療花費(fèi)的特征,成為當(dāng)前世界各國(guó)共同面對(duì)的公共健康問(wèn)題。DM在中國(guó)的嚴(yán)峻形勢(shì)更是發(fā)人深省。在最新一期國(guó)際著名醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上,一篇名為“中國(guó)人群中的DM患病率”的研究論文公布了最近調(diào)查結(jié)果:中國(guó)DM患者人數(shù)達(dá)9200萬(wàn),數(shù)量達(dá)到世界第一

2、。其增長(zhǎng)速度令人震驚。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是DM患者最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的全身性微血管并發(fā)癥之一。在歐美國(guó)家DN占終末期腎臟病(end stage renar disease,ESRD)透析病人第一位的病因,而在我國(guó),DN雖不是ESRD的首要病因,但每年以高速率遞增。DN是腎臟疾病中治療最為困難、發(fā)展速度快、預(yù)后差,進(jìn)展成ESRD醫(yī)療費(fèi)用高的嚴(yán)重危害人民健康的繼發(fā)性腎小球疾病。因此,明確DN的發(fā)病機(jī)制及

3、治療方法成為了當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中首當(dāng)其沖要解決的問(wèn)題。
　　 既往研究認(rèn)為,DN的主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)的堆積、系膜增寬、基底膜增厚,腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。然而這些因素僅能解釋30％-50％的尿蛋白排泄率和腎小球?yàn)V過(guò)率的變化。DN的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。近年來(lái),隨著對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)和功能改變的研究,尤其是對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)屏障結(jié)構(gòu)成分的足細(xì)胞在DN的發(fā)生發(fā)展中的作用,成為研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)證實(shí)足細(xì)胞的異常改變是DN的主要病理

4、學(xué)改變,并和其相關(guān)蛋白的改變一起在DN的發(fā)病中起到關(guān)鍵性作用。足突細(xì)胞裂孔隔膜(slitdiaphragm,SD)是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成成分,起到“靜態(tài)分子篩”的作用,同時(shí)它又是高度“動(dòng)態(tài)”的功能復(fù)合體,參與了對(duì)維系足細(xì)胞正常生物學(xué)所必須的信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)生與傳遞和細(xì)胞骨架的組成。CD2AP(CD2-associated protein)是構(gòu)成其信號(hào)傳導(dǎo)的主要分子,主要與podocin和nephrin以蛋白復(fù)合體的形式存在。CD2AP基

5、因敲除的小鼠可發(fā)生先天性腎綜。研究發(fā)現(xiàn),其還可能與actin相互結(jié)合,將nephrin錨定在actin細(xì)胞骨架上的作用。ZO-1(zonula occudens-1)是細(xì)胞骨架接頭蛋白之一,能將SD相關(guān)蛋白連接到細(xì)胞骨架上,對(duì)維持足突細(xì)胞的完整性有重要的作用。近期研究發(fā)現(xiàn),它又能與SD組成蛋白之一的NEPH1(足細(xì)胞的一種組成蛋白)相結(jié)合,誘導(dǎo)其信號(hào)傳導(dǎo)。而CD2AP在蛋白復(fù)合體中是否通過(guò)作為NEPH1的同源分子nephrin(足細(xì)胞的

6、一種主要的組成蛋白)與ZO-1有聯(lián)系作用,且在DN病變過(guò)程中,ZO-1表達(dá)的變化以及它與足細(xì)胞數(shù)目減少的關(guān)系至今還未完全闡明。
　　 目前西醫(yī)治療DN主要是控制高血糖、減少蛋白尿、控制高血壓、低蛋白飲食及糾正脂代謝紊亂等對(duì)癥治療。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)類(lèi)藥物及血管緊張素Ⅱ(AngioteninⅡ,AngⅡ)受體拮抗劑能減少蛋

7、白尿,具有一定程度保護(hù)DN腎臟的作用,但它們也不能完全阻斷DN進(jìn)展。而中醫(yī)方面在延緩DN病情的進(jìn)展和腎衰竭方面顯示出良好的效果,但DN臨床分型無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和量化指標(biāo),涉及方藥很多,且有一些自擬方,藥物加減變化較大,療效標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一,限制了其推廣應(yīng)用。目前DN缺乏有效的藥物治療,至今尚沒(méi)有一個(gè)能完全阻止DN進(jìn)展的藥物。中醫(yī)藥從CD2AP和ZO-1方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此,積極探求DN的治療與CD2AP、ZO-1的關(guān)系具有重要意義。
　　

8、 第一章腎康丸對(duì)DN大鼠腎臟的保護(hù)作用以及對(duì)腎組織CD2AP、ZO-1的影響
　　 [目的]探討腎康丸對(duì) DN大鼠模型的腎臟保護(hù)作用以及對(duì)CD2AP和ZO-1表達(dá)的影響,為進(jìn)一步研究藥物作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1.DN大鼠模型的制備:首先用鏈脲佐菌素(STZ)以55 mg·kg-1大鼠體重左下腹腔內(nèi)一次性注射制作DM大鼠模型。連續(xù)喂養(yǎng)2w,測(cè)血糖、尿量,若血糖值>16.6mmol·L—1、

9、尿量>原尿量150％、尿蛋白排泄>30mg·kg·/24h-1以上,則造模成功。
　　 2.分組和給藥:大鼠造模成功后,稱(chēng)重,隨機(jī)分為4組:模型對(duì)照組,美卡素組和腎康丸組,另設(shè)正常對(duì)照組。腎康丸組大鼠實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定為1.1g·kg-1大鼠體重,腎康丸研磨后用蒸餾水配成0.22g·mL-1混懸液。美卡素片組大鼠實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定為7.2mg·kg-1大鼠體重,美卡素片研磨后用蒸餾水配成2.9mg·mL-1溶液。模型對(duì)照和正常對(duì)照組大鼠灌服

10、等容積生理鹽水。分別灌服相應(yīng)藥物濃度的混懸液,每日1次,連續(xù)8 w。各組大鼠自由進(jìn)食飲水,實(shí)驗(yàn)中不予任何降血糖藥物。
　　 3.療效觀察與檢測(cè):
　　 ①一般情況的影響:活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)、攝食量、飲水量、大小便、體重。
　　 ②對(duì)大鼠腎重、相對(duì)腎重的影響。
　　 ③對(duì)大鼠血脂(生化法)、尿肌酐(苦味酸法)、血糖(血糖儀)、糖化血紅蛋白(紫外分光光度法)、24 h尿蛋白總量(考馬斯亮蘭法)的影響。

11、>　　 ④對(duì)大鼠腎組織病理的影響(光鏡、透射電鏡觀察)。
　　 4.免疫組化法研究CD2AP和ZO-1在正常大鼠和DN大鼠腎臟組織的分布和表達(dá)情況。
　　 [結(jié)果]
　　 1.46只大鼠用于造模,成模率78.9％(30/38),成模后病死率4.67％(2/30)。
　　 2.8周治療期間,模型組大鼠血糖均維持在16.7mmol·L-1以上,尿糖卅以上,表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的DM癥狀,腎康丸、美卡

12、素治療組大鼠一般情況均較模型對(duì)照有所改善。
　　 3.正常對(duì)照組及各治療組大鼠體重均較治療前增加(P<0.05或P<0.01)；與模型對(duì)照組相比較,腎康丸組與美卡素組增長(zhǎng)量顯著增加(P<0.01,P<0.05)。
　　 4.與正常對(duì)照組比較,各組大鼠血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c均升高(P<0.01),24h尿量及飲水量增加(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較,腎康丸、美卡素治療均可以

13、降低24hUpro、Scr、BUN及24h尿量及飲水量(P<0.01或P<0.05)；腎康丸治療可以降低血糖、GHb(P<0.05)。各組中,僅腎康丸組TC、TG、LDL-c顯著下降(P<0.01)。
　　 5.與正常對(duì)照組比較,各組大鼠HDL-c顯著降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比,腎康丸治療組對(duì)HDL-c具有顯著升高作用(P<0.01)。
　　 6.與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠腎重及相對(duì)腎重增加(P<0.01)

14、,且出現(xiàn)了相當(dāng)于Mogensen分期的3期左右DN病理?yè)p害。腎康丸、美卡素病理改變較模型組均有不同程度的減輕,其中腎康丸組效果更為顯著。
　　 7.免疫組化法觀察正常大鼠腎組織中CD2AP主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞內(nèi),在腎小管,集合管也有少量表達(dá)。而ZO-1主要沿著腎小球毛細(xì)血管袢呈點(diǎn)狀分布。與正常組相比,模型對(duì)照組中CD2AP及ZO-1表達(dá)明顯下降,而治療組其表達(dá)逐步恢復(fù)正常。其中,腎康丸組CD2AP及ZO-1表達(dá)量與正常組無(wú)明顯

15、差別。
　　 [結(jié)論]
　　 1.腎康丸能夠改善實(shí)驗(yàn)性DN大鼠一般狀態(tài),具有一定的調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝的作用。
　　 2.腎康丸能夠降低實(shí)驗(yàn)性DN大鼠尿蛋白,降低血清BUN及Scr水平,具有一定的保護(hù)腎功能作用。
　　 3.腎康丸能夠改善DN大鼠腎臟組織病理學(xué)改變,緩解腎臟病理?yè)p傷。
　　 4.腎康丸能上調(diào)CD2AP及ZO-1在DN腎臟組織中的含量,且抑制其易位。
　　 第二章腎康丸對(duì)高糖刺

16、激的大鼠腎小球足細(xì)胞CD2APmRNA表達(dá)的影響
　　 [目的]探討腎康丸對(duì)高糖刺激下的大鼠腎小球足細(xì)胞(podocyte,PC)CD2APmRNA表達(dá)的影響。
　　 [方法]
　　 1.含藥血清的制備:雄性SPF級(jí)SD大鼠25只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為5組,分別灌服相應(yīng)藥物濃度的腎康丸(高、中、低劑量)和美卡素混懸液及等容積生理鹽水制作腎康丸高、中、低劑量含藥血清,美卡素含藥血清和正常血清。
　　 2

17、.PC培養(yǎng)分組、干預(yù)及活力測(cè)試:由廣東省人民醫(yī)院惠贈(zèng),取生長(zhǎng)狀態(tài)好的已分化的足細(xì)胞隨機(jī)分為7組:正常糖組、高糖刺激組、高糖刺激加正常血清組、腎康丸高、中、低劑量組,美卡素組,每組5孔,以相應(yīng)的試劑及藥物血清干預(yù)24小時(shí)和48h后,進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。
　　 3.根據(jù)活力檢測(cè)的結(jié)果選擇效價(jià)最高的腎康丸含藥血清組進(jìn)行PC細(xì)胞的培養(yǎng),再次選取一批生長(zhǎng)狀態(tài)好的己分化的PC細(xì)胞,并將其分為5組:正常糖組、高糖刺激組、高糖刺激加正常血清組、腎

18、康丸組和美卡素組,每組設(shè)6孔。研究其對(duì)DN大鼠腎小球足細(xì)胞CD2APmRNA表達(dá)的影響。
　　 4.RT-PCR法檢測(cè)足細(xì)胞中CD2APmRNA表達(dá):Trizol法提取和純化PC總RNA,以0.1％DEPC處理水50μl溶解后分裝,加RNAin保存于-70℃冰箱。設(shè)計(jì)CD2AP及內(nèi)參GAPDH引物序列,取總RNA2μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。內(nèi)參照采用GAPDH,檢測(cè)PC中C

19、D2APmRNA的表達(dá)。
　　 5.用Western blm法檢測(cè)足細(xì)胞CD2AP的含量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.48h內(nèi),腎康丸中劑量較其他劑量對(duì)高糖刺激下的足細(xì)胞損害的緩解效力最好。
　　 2.與正常組比較,模型組大鼠腎臟CD2AP mRNA表達(dá)量減少(P<0.05)；與模型組比較,腎康丸組、美卡素組均可上調(diào)CD2APmRNA的表達(dá),但以腎康丸組上調(diào)顯著(P<0.01),且與正常組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

20、義(P>0.05)。
　　 3.用Western blot法觀察到高糖組和正常血清組中CD2AP蛋白表達(dá)明顯低于正常糖組,而腎康丸組和美卡素組則稍略低于正常糖組,但與高糖和正常血清組相比則明顯增多。
　　 [結(jié)論]腎康丸可以上調(diào)高糖刺激下的PC中CD2APmRNA及蛋白表達(dá)。
　　 第三章腎康丸對(duì)高糖刺激的大鼠腎小球足細(xì)胞ZO-1mRNA表達(dá)的影響
　　 [目的]探討腎康丸對(duì)高糖刺激下的PC中ZO—1mR

21、NA表達(dá)的影響。
　　 [方法]
　　 同上。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與正常組比較,模型組大鼠腎臟ZO—1mRNA表達(dá)量減少(P<0.05)；與模型組比較,腎康丸組、美卡素組均可上調(diào)ZO-1mRNA的表達(dá),但以腎康丸組上調(diào)顯著,與高糖組及正常血清組相比有顯著性差異(P<0.01),且與正常組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.用Western blot法觀察到高糖組和正常血清組中Z

22、O-1mRNA蛋白表達(dá)明顯低于正常糖組,而腎康丸組和美卡素組則稍略低于正常糖組,但與高糖和正常血清組相比則明顯增多。
　　 [結(jié)論]腎康丸可以上調(diào)高糖刺激下的PC中ZO-1mRNA及蛋白表達(dá)。全文結(jié)論:本研究通過(guò)DN動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究,再次證明腎康丸具有治療DN和保護(hù)腎臟的作用；通過(guò)觀察腎康丸對(duì)DN大鼠及體外高糖培養(yǎng)的PC細(xì)胞中CD2AP和ZO-1mRNA的表達(dá)情況,提示其可上調(diào)CD2AP和ZO-1的表達(dá),從而能維持腎小球足細(xì)胞結(jié)