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文檔簡介
1、目的:本研究通過對急性心肌梗死患者外周血來源的Exosomes的定量、定性分析,探討急性心肌梗死患者Exosomes與心肌酶學濃度、冠脈病變程度的相關性。進一步了解外周血來源的Exosomes水平在心肌梗死發(fā)生發(fā)展中的作用及其對急性心肌梗死的預測以及應用價值。
方法:1、臨床病人的選擇:選擇2010-9~2011-5因胸痛可疑冠狀動脈疾病CAD在我院心內(nèi)科住院的93例患者進行選擇性冠狀動脈造影。并將93例患者分為以下四組:
2、N組(24例,正常對照組),AMI組(23例,急性心肌梗死組),SA組(24例,穩(wěn)定性心絞痛組),UA組(22例,不穩(wěn)定心絞痛組)。2、外周血Exosomes的提取:于病人行冠狀動脈造影術過程中取動脈血40ml,F(xiàn)icoll離心得血漿,等量PBS稀釋,經(jīng)2000g*30min離心,將上清轉入到超離管中12,000×g,離心45min,4 ℃,之后轉移到另外一只超離管中11,000g*2h,4 ℃,1ml PBS重懸,補足PBS,經(jīng)0.2
3、2 μm濾器過濾,11,000g*70min離心后得到Exosomes,50μl-200μl PBS重懸,-80度冰箱保存以備下一步實驗需要;3、BCA定量:取Exosomes樣本2ul,稀釋5倍,按照樣本與底物1:20的比例,在nanodrop上進行BCA protein定量;4、流式分析:5ugExosomes與4 μm 直徑的醛/硫酸乳膠珠在室溫結合15 min,加PBS補充至1ml,室溫震蕩2 h,加入1mol/L甘氨酸30mi
4、n阻斷反應,4000rpm離心3min,棄上清,PBS/0.5% BSA洗滌3次,500ul PBS/0.5%BSA重懸,取出10ul結合Exosomes的磁珠分別加入PE-CD11c單克隆抗體、PE-CD81單克隆抗體、APC/cy7-MHC Ⅱ單克隆抗體、pacific bule-CD86單克隆抗體、PE-CD106單克隆抗體、PE-CD54單克隆抗體、FITC-CD3單克隆抗體及相應的同型對照,避光孵育1h,PBS洗滌3次,上機檢
5、測[1]。5、記錄總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、CK、CK-MB、CK-MM、空腹血糖(FPG),同時測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、年齡、性別等相關指標,詢問吸煙史、高血壓病史及糖尿病史。以冠脈病變支數(shù)和Gensini積分評價冠脈病變嚴重程度。6、采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。多組
6、之間比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗;P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用方差分析,各率及例數(shù)的比較用卡方檢驗(χ2檢驗);Exosomes與CK、Gensini積分等的單因素相關分析應用Spearman秩相關。冠心病危險因素分析采用二分類Logistic回歸分析,回歸模型以Gensini積分為因變量,年齡、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、白細胞計數(shù)、CD11C、CD86、
7、MHC-DR、CK、CK-MM、CK-MB等為自變量。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果:1、AMI與UA患者Exosomes的定量水平顯著高于正常對照組,AMI組Exosomes的表達量顯著高于SA組,患者Exosomes的表型分析顯示,AMI患者表達的CD11C、CD86、MHC-DR顯著高于正常組;2、AMI和UA組Exosomes水平與Gensini積分均高于SA組,提示其與冠脈病變斑塊的穩(wěn)定性有關。3、外周
8、血Exosomes水平與患者血清CK、CK-MB、CK-MM水平、WBC呈正相關。4、外周血Exosomes水平隨著Gensini積分增加而增大,呈正相關,可反映Exosomes還與冠狀動脈粥樣硬化病變的嚴重程度有關。
結論:本研究表明外周血Exosomes與急性心肌梗死的發(fā)生及其嚴重程度相關。外周血Exosomes與血清CK、CK-MB、CK-MM水平、Gensini積分、WBC呈正相關。除了心肌酶水平與冠狀動脈造影外,
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